Ефективне кріоконсервування нервових стовбурових або клітин-попередників без сироватки або білків
Інформація про статтю
1 Ці автори в рівній мірі внесли свій внесок у цю роботу. Відділ збереження низької температури, Медичний інститут Національного університету, Медичний факультет Йон Лоо Лін, Національний університет Сінгапуру, блок MD 11 # 03-01C, 10 Medical Drive, Сінгапур 117597. Тел: + 65- 6516-3359; Факс: + 65-6773-5461; Електронна пошта: [захищений електронною поштою] Кафедра фармакології, Медична школа Йон Лоо Лін, Національний університет Сінгапуру, 10 Medical Drive, Сінгапур 117597. Тел: + 65-6516-8864; Факс: + 65-6873-7690; Електронна пошта: [електронна пошта захищена]
Анотація
Вступ
Передбачається, що стерильні та вільні від ксенону протоколи культури та зберігання будуть вимогою для остаточного реалізації клінічного застосування НСПК. Стерильні та відтворювані протоколи кріозберігання також сприятимуть фундаментальним дослідженням. Як вже обговорювалося в галузі досліджень мезенхімальних та ембріональних стовбурових клітин [огляд див. (13, 23, 24)], використання похідних тварин та інших органічних компонентів збільшує ризик забруднення та мінливість між партіями. З огляду на вимогу до стерильності, ми продемонстрували, що кріоконсервація біологічного матеріалу за допомогою склування може бути досягнута за допомогою лише небіологічних добавок (17, 19, 22, 32, 38). Ми також розробили протокол із використанням герметичної конфігурації "солома-в-соломі" (250 мкл стерильної соломи, поміщеної в 500 мкл соломи), що дозволяє підтримувати стерильність під час кріоконсервації (18, 19). Протокол є економічно і економічно ефективним, оскільки він не потребує дорогих апаратів повільного охолодження і вимагає лише безпосереднього занурення в рідкий азот для охолодження.
Матеріали і методи
Культура НСПК
Вагітним мишам C57BL/6J знеболювали, а плоди ембріонального дня 14 (E14) хірургічно витягували. Гіпокампі розтинали і розщеплювали в 0,25% розчині трипсину-ЕДТА (Gibco, Каліфорнія, США) протягом 30 хв з розтиранням кожні 15 хв.
Двічі додавали об'єм PBS, щоб зупинити травлення, і тканини просівали 70-мкм сітчастим фільтром. Зразки центрифугували для осадження клітин, а потім клітини висівали на нейросферне середовище. Нейросферне середовище складалося з DMEM/F12 (Gibco), доповненого добавкою N2 (Gibco), 20 нг/мл EGF (Gibco) та 10 нг/мл bFGF (Gibco). Через 2–3 тижні в культурі були присутні видимі нейросфери і культура була пассирована. Для проходження нейросфери дозволяли осісти в мікроцентрифужній пробірці, а потім механічно дисоціювали за допомогою піпетки об'ємом 200 мкл перед заміною у свіжому нейросферному середовищі. Усі експерименти на тваринах були схвалені Інституційним комітетом з догляду та використання тварин (IACUC) Національного університету Сінгапуру і проводились відповідно до Керівництва з догляду та використання лабораторних тварин, Національний інститут охорони здоров’я, США.
Вітрифікація нейросфер
Рисунок 1. Схематичне зображення процедур вітрифікації-нагрівання та розведення для кріоконсервації NSPC. Загальна концентрація розчиненої речовини відноситься до розчинів ЕГ, за винятком розчину, позначеного зірочкою (*), який складається з ЕГ + сахарози (40% об./Об. ЕГ та 0,6 М сахарози).
Прогрівання нейросфер та розведення кріопротекторів
Соломку, що містить нейросфери, нагрівали зануренням у водяну баню при температурі 38 ± 0,5 ° С на 30 с при безперервному струшуванні. Потім нейросфери розпаковували і виганяли в 1 М сахарозу в DMEM/F12 у 15-мл пробірці для центрифуги. Концентрацію сахарози поступово знижували до 0,7 М шляхом розведення 0,25 М сахарози в DMEM/F12, а потім на 0,175 М при поетапному розведенні DMEM/F12. Тривалість етапів нагрівання та розведення схематично представлена на рисунку 1. Потрібна була вся процедура розведення
15 хв. Всі обробки проводили при кімнатній температурі (23 ± 2 ° C). Потім нейросферам давали можливість потонути. Потім надлишок розчину видаляли і нейросфери промивали в культуральному середовищі нейросфери перед тим, як помістити їх в інкубатор. Через 30 хв їх переносили у свіжі культуральні середовища для звичайної культури до подальшого аналізу.
Аналіз на маркери нервових стовбурових клітин
Щоб визначити, чи впливала вітрифікація на стан нервового стовбура або клітини-попередника, дисоційовані NSPC висівали на предметне покриття з покриттям з полі-L-орнітин/фібронектину в моношарі та витримували протягом 3 днів у нейросферному середовищі. Потім попередник або стовбурові клітини фіксували обробкою 4% параформальдегідом протягом 20 хв. Імуноофарбовування проводили послідовно, використовуючи анти-Sox2 (AB5603, Chemicon, Tenecula, CA, USA) та анти-нестин (MAB353, Chemicon) антитіла для ідентифікації маркерів клітин нервових стовбурів або клітин-попередників. Кон'юговані флуоресценцією вторинні антитіла Alexa Fluor (Invitrogen, CA, USA) використовувались для візуалізації первинних антитіл, а покривні склянки були забарвлені DAPI у середовищі для монтажу Prolong Antifade Gold (Invitrogen). Потім імунозабарвлені клітини знімали шляхом послідовного сканування за допомогою конфокального мікроскопа (LSM 510, Carl Zeiss Microimaging GmbH, Німеччина).
Аналіз розмноження клітин
Для того, щоб визначити швидкість проліферації клітин NSPC, контрольні нейросфери ретельно промивали за допомогою культурального середовища перед дисоціацією та фарбуванням, імітуючи процес розведення склоподібної групи для забезпечення послідовності процедури. Нейосфери дисоціювали за допомогою 0,25% розчину трипсину-ЕДТА і клітини замінювали на покривних покриттях з полі-L-орнітином/ламініном. Клітинам давали прилипати до покривних склінок, а потім 5-бром-2′-дезоксиуридин (BrdU; Sigma-Aldrich, MO, США) додавали до живильного середовища до кінцевої концентрації 10 мкМ та інкубували з дисоційованими NSPC для 24 год. Потім клітини фіксували 4% параформальдегідом протягом 20 хв. Імуноофарбовування проводили для виявлення включення BrdU з використанням анти-BrdU антитіла (1: 100, BRD.3, Neomarkers, Lab Vision Corporation, Каліфорнія, США) та виявляли за допомогою кон'югованого вторинного антитіла Alexa Fluor 555 (Invitrogen). Клітини фарбували DAPI, щоб виявити всі ядра. Клітини знімали шляхом послідовного сканування конфокальним мікроскопом (Fluoview 1000, Olympus, Японія). Сліпий до умов лікування дослідник підрахував кількість BrdU-імунореактивних клітин та DAPI-позитивних ядер, а кількість BrdU-позитивних клітин виражали у відсотках від загальної кількості клітин.