Експресія гена рецептора 5-HT1A мозку в режимі сплячки - Науменко - 2008 - Гени, мозок та

Інститут цитології та генетики

* V. Науменко, Лабораторія поведінкової нейрогеноміки, Інститут цитології та генетики, Сибірський відділ Російської академії наук, проспект Лаврентьєва 10, 630090, Новосибірськ, Росія. Електронна пошта: [email protected] Шукати інші статті цього автора

Інститут хімічної біології та фундаментальної медицини Сибірського відділу Російської академії наук, Новосибірськ

Інститут цитології та генетики

Інститут клітинної біофізики Російської академії наук, м. Пущино, Росія

Інститут цитології та генетики

Інститут клітинної біофізики Російської академії наук, м. Пущино, Росія

Інститут цитології та генетики

Анотація

Зимова сплячка ссавців представляє унікальну модель для вивчення механізмів, що регулюють фізіологічні системи, поведінку та природну толерантність до ішемії та переохолодження. Особливий інтерес представляють мозкові механізми, які використовуються сплячками для переходу від нормального евтермічного стану до сплячки, що характеризується глибоким зміною температури тіла. У сплячого ховраха температура тіла знижується майже до навколишнього середовища, іноді до 1,5–3 ° C, і спостерігається супутнє зниження (до 1–5% швидкості евтермії) частоти серцевих, дихальних та метаболічних процесів (Barnes 1989; Попова 1986). Мозок сплячого сплячого ссавця витримує фізіологічні крайнощі, смертельні для негібернаторів. Ідентифікація генів та нейромедіаторних механізмів, що лежать в основі цієї природної адаптаційної поведінки, є ключовим першим кроком до розуміння пластичності мозку та центрального механізму виживання.

За останні десятиліття було описано 14 різних підтипів 5-НТ-рецепторів, які були розділені на сім сімей на основі операційних (пов'язаних з наркотиками), трансдукційних (зв'язок рецепторів) та структурних (первинна амінокислотна послідовність) характеристик. Всі 5-НТ-рецептори, крім одного (тип 5-НТ3), є метаботропними рецепторами, пов'язаними з білками G; структурно та функціонально відмінний від усіх інших типів рецепторів 5-НТ, рецептор 5-HT3 є іонотропним ліганд-іонованим рецептором іонного каналу (Barnes & Sharp 1999).

Серед дивовижного різноманіття клонованих та ідентифікованих 5-НТ-рецепторів особлива увага приділяється 5-НТ1А-рецептору через дані про його участь у контролі тривожності (Heisler та ін. 1998; Nutt & Glue 1991), сон (Деррі та ін. 2006; Вільсона та ін. 2005) та переохолодження (Hjorth 1985; Overstreet та ін. 1996), вказуючи на те, що рецептор 5-HT1A може брати участь у підтримці глибокого переохолодження та виснаження, типових для сплячки. У той же час не було даних про мозкові 5-HT1A-рецептори в циклі сну і неспання, а також не було інформації про ген 5-HT1A-рецепторів у сплячих режимів.

Метою даної роботи було дослідити експресію гена рецептора 5-HT1A в мозку сплячих зимуючих ховрахів на різних стадіях циклу сну і неспання. У базах даних не було даних про послідовності генів рецепторів 5-HT1A у ховрахів, тому для визначення експресії рецептора першим етапом нашого дослідження було визначення послідовності гена рецептора 5-HT1A у ховрахів.

Матеріали і методи

Предмети тварин

Експерименти проводились на ховрах-самцях (Spermophilus undulatus) вагою 600–800 г. Тварини потрапили в пастку в Якутії наприкінці серпня. В Інституті біофізики Російської академії наук, м. Пущино, ховрахів знаходився під ветеринарним спостереженням у спеціальному віварії. Тварин утримували індивідуально в клітках розміром 35 × 40 × 20 см із вільним доступом до їжі та води. Світло вмикалося з 0700 год до 1900 год. В кінці жовтня тварин поміщали в спеціальну камеру з постійною температурою, що наближається до природних умов (+ 4 ° C). Експерименти проводились на чотирьох групах ховрах (по 10 тварин у кожній групі), обезголовлених на різних стадіях циклу сну і неспання: (1) у липні - активні тварини (температура тіла 37 ° С); (2) у жовтні - підготовлений до сплячки, але ще евтермічні тварини (температура тіла 37 ° C); (3) у січні - тварини, що зимують (температура тіла 4 ° C), і (4) у квітні - тварини, які виходять з режиму сплячки (температура тіла 28 ° C). Збудження було спровоковано переведенням тварин у лабораторне приміщення з температурою навколишнього середовища 21–22 ° C. Температуру тіла вимірювали в товстій кишці за допомогою електричного термометра.

Після швидкої декапітації мозок видалили на льоду, а потім виділили лобову кору, гіпокамп та середній мозок. Зразки кори з симетричних областей лобових областей двобічно (Schober 1986), всього правого гіпокампу та каудальної частини стовбура мозку, в т.ч. n. спинка рафе і n. raphe medianus (Konig & Klippel 1963), були взяті. Мозкові структури негайно заморожували у рідкому азоті та зберігали при -65 ° C до вилучення РНК.

Усі експериментальні процедури проводились відповідно до Керівних принципів етичної поведінки у догляді та користуванні тваринами (розроблений Комітетом з досліджень та етики тварин, 1991; http://www.apa.org/science/anguide.html).

Ланцюгова реакція зворотної транскриптази – полімерази та секвенування

Загальну РНК виділяли, використовуючи екстракцію тіоціанатом гуанідину, фенолом та хлороформом (Chomczynski & Sacchi 1987) із модифікаціями (Naumenko & Kulikov 2006). Отриману загальну РНК зберігали в 70% етанолі при -20 ° C для передачі в Інститут цитології та генетики м. Новосибірськ, а потім загальну РНК осаджували, сушили і розчиняли в обробленій водою, обробленій діетилпірокарбонатом, до концентрації 0,125 мкг/мкл. і зберігається при -65 ° C.

Зворотна транскрипція була виконана, як описано в інших місцях (Науменко та Куліков 2006). Синтезовану комплементарну ДНК (кДНК) зберігали при -20 ° C.

Ланцюгову реакцію полімерази (ПЛР) проводили з використанням праймерів, спрямованих на мишачий ген рецептора 5-НТ1А, відповідно до таких умов: (1) 5 хв при 94 ° C, 1 цикл, (2) 40 секунд при 94 ° C, 40 секунд при 59 ° C і 40 секунд при 72 ° C, 36 циклів і (3) 4 хвилини при 72 ° C, 1 цикл (таблиця 1).

Генна нуклеотидна послідовність Температура відпалу (° C) Розмір продукту ПЛР (bp)

Ген-рецептор мишачого 5-HT1A	F 5′ ‐ acttggctcattggctttctcat ‐ 3 ′	59	602
	R 5′ ‐ ggcagccagcagaggatgaa ‐ 3 ′
β-актин	F 5′ ‐ cggaaccgctcattgcc ‐ 3 ′	61	285
	R 5′ ‐ acccacactgtgcccatcta ‐ 3 ′
Ген рецептора 5-HT1A ховрахів	F 5′‐ takccactttcggcgctttctatat ‐ 3 ′	60	330
	R 5′‐ cagtggcaggtgctctttggagtt ‐ 3 ′