Генетичний дефект sld
Бісвадіп Дас
З кафедри усної біології Стоматологічного коледжу Університету Флориди, Гейнсвіл, Флорида 32610,
Мелані Н. Кеш
З кафедри усної біології Стоматологічного коледжу Університету Флориди, Гейнсвіл, Флорида 32610,
Ніжно Робінзон
З кафедри усної біології Стоматологічного коледжу Університету Флориди, Гейнсвіл, Флорида 32610,
Крістофер С. Кунс
З кафедри усної біології Стоматологічного коледжу Університету Флориди, Гейнсвіл, Флорида 32610,
Ліза Р. Латні
§ Центр усної біології Медичного центру Рочестерського університету, Рочестер, Нью-Йорк 14642,
Маргарет А. Фаллон
§ Центр усної біології Медичного центру Рочестерського університету, Рочестер, Нью-Йорк 14642,
Розмарі В. Елліот
¶ Департамент молекулярної та клітинної біології Інституту раку в Розуеллі, Нью-Йоркський департамент охорони здоров’я, Баффало, Нью-Йорк 14263, та
Артур Р. Хенд
‖ Відділи краніофаціальних наук та клітинної біології, Школа стоматології, Центр охорони здоров’я Університету штату Коннектикут, Фармінгтон, штат Коннектикут 06030
Девід Дж. Калп
З кафедри усної біології Стоматологічного коледжу Університету Флориди, Гейнсвіл, Флорида 32610,
§ Центр усної біології Медичного центру Рочестерського університету, Рочестер, Нью-Йорк 14642,
Пов’язані дані
Анотація
Вступ
Муцини - це сильно глікозильовані глікопротеїни, гени яких позначаються як MUC1 - MUC22, залежно від порядку їх відкриття. Муцини згруповані в три родини: 1) великі гелеутворюючі та секретуються муцини, 2) розчинні та секретуються муцини та 3) муцини, асоційовані з муцинами (1, 2). Великі гелеутворюючі муцини складаються з Muc2, Muc5ac, Muc5b, Muc6 та Muc19. Гелеутворюючі муцини - це продукти екзокринної секреції поверхневих келихоподібних клітин та клітин слизової залози дихальних шляхів, травного тракту, сечостатевої системи, очей, внутрішнього вуха та слинової системи. Ці муцини полімеризуються у водомісткі високомолекулярні мережі із захисними функціями, включаючи гідратацію та змащення тканинних поверхонь, а також взаємодію з патогенами як окремо, так і у складі великих молекулярних комплексів з іншими молекулами, що секретуються у шарі слизу (3, 4). . У слині людини MUC5B добре розпізнається як основний компонент муцину (5), а транскрипти MUC19 локалізуються в слизових клітинах слинних залоз (6).
Як альтернативний підхід у розмежуванні механізмів, що контролюють експресію Muc19, ми вивчаємо модель миші NFS/N-sld. Ці миші мають спонтанну аутосомно-рецесивну мутацію, слд, спочатку характеризується як уповільнений та обмежений розвиток слизових клітин у під’язикових слинних залозах (15–17). З тих пір ми продемонстрували, що мутація sld порушує експресію Muc19, як свідчать ультраструктурні та імуногістохімічні дослідження, але без впливу на експресію інших секретованих білків, а також на глобальну експресію білка (15). Оскільки Muc19 є єдиним гелеутворюючим муцином під’язикових залоз, неонатальні залози мишей sld позбавлені великих екзокринних гранул, типових для фенотипу слизових клітин. Тим не менше, фенотип слизових клітин починає з’являтися і збільшуватися в кількості клітин постнатально. Усі ці клітини експресують Muc19, але обмежені, оскільки клітини фенотипу слизових клітин складають менше половини популяції клітин у віці 1 року (15). Відповідно, транскрипти Muc19 ледь виявляються, а глікопротеїни Muc19 не виявляються у новонароджених sld, хоча обидва поступово з’являються постнатально разом із зростаючим виглядом клітин фенотипу слизових клітин (15).
ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНІ ПРОЦЕДУРИ
Матеріали
Якщо не вказано, всі основні солі та буфери були від Sigma, а молекулярні реагенти та набори, ферменти та реагенти для культури - від Invitrogen. Всі набори використовувались відповідно до інструкцій виробника.
Тварини та колекція залоз
Університет Флориди, Університет Цинциннаті та Університет Рочестера Інституційні комітети з догляду та використання тварин затвердили всі процедури з тваринами. Миші NFS/NCr та NFS/N-sld були з наших власних колоній для розмноження, що утримувались в умовах BSL2. Мишей NFS/NCr отримували спочатку за програмою тварин Національного інституту раку (Charles River Laboratories, Frederick, MD). Мишей NFS/N-sld отримували спочатку від Центрального інституту експериментальних тварин (Кавасакі, Японія), як описано раніше (15). Мишей евтаназували знекровленням після наркозу діоксидом вуглецю. Якщо не вказано, усі вирізані тканини промокли на фільтрувальному папері, швидко заморозили і зберігали в рідкому азоті. Для визначення мокрої ваги заморожені тканини швидко зважували перед використанням з мікровагою Mettler MT-5 (Mettler Toledo, Columbus, OH).
Генетичне картографування та RT-PCR транскриптів у критичному регіоні
Геномну ДНК виділяли з нирок за допомогою набору DNeasy (Qiagen). Поліморфні геномні маркери (сайти з позначеною послідовністю (STS)) 3 включали створений Массачусетський технологічний інститут (MIT) STS та маркери STS D15Roc1–12, які ми розробили з простих геномних повторень, визначених програмою COMPILE_SIMPLE сервера анотацій послідовностей RUMMAGE (19) . Хромосомна локалізація та розміри ампліконів MIT STS наведені в додатковій таблиці S1. Послідовності праймерів, розміри ампліконів, номери приєднання GenBank TM для D15Roc1–12 та умови ПЛР наведені в додатковій таблиці S2. Для фенотипу sld-мутантів гомогенати під’язикових залоз, приготовані з мишей F2 у віці 3 тижнів, аналізували на наявність або майже відсутність (мутантний фенотип) високомолекулярних глікопротеїдів.
Для виділення РНК заморожені тканини гомогенізували безпосередньо в реагенті TRIzol, використовуючи Mini Bead Beater 8 (BioSpec Products, Bartlesville, OK) протягом 90 с у присутності 500 мг кульки карбіду силікону (розміром 1 мм). РНК виділяли відповідно до вказівок виробника та обробляли ДНКазою I за допомогою набору реагентів без ДНК Ambion (Applied Biosystems, Фостер-Сіті, Каліфорнія). Чистоту РНК оцінювали за допомогою капілярного електрофорезу (Agilent 2100 Bioanalyzer; Agilent Technologies, Inc., Санта-Клара, Каліфорнія). Номери цілісності РНК коливались від 8,7 до 9,5. РНК, оброблену ДНКазою I (5 мкг), транскрибували зворотними випадковими праймерами, використовуючи архівний набір кДНК великої ємності (Applied Biosystems), а отриману кДНК очищали за допомогою системи очищення ПЛР QIAquick (Qiagen). Кількісно визначали РНК і кДНК за допомогою набору для аналізу РНК Quant-iT або набору для аналізу Quant-iT dsDNA HS з флуорометром Qubit. Умови ПЛР та конкретні праймери, що використовуються для виявлення транскриптів у критичному інтервалі, наведені в додатковій таблиці S3. Продукти ПЛР були підтверджені прямим секвенуванням гелеочищених смуг (комплект для екстракції гелю QIAquick; Qiagen).