Гіпоалергенний варіант основного алергену яєчного білка Gal d 1, що виробляється внаслідок порушення цистеїну
Патхум Дханапала
1 Нейрологічна дослідницька лабораторія (NARL), Школа наук про життя та навколишнє середовище, Факультет природничих наук, техніка та побудова навколишнього середовища, Університет Дікін, 75 Pigdons Road, Geelong 3216 VIC, Австралія; ua.ude.nikaed@muhtapd або ude.dravrah.hwb@alapanahdp (P.D.); ua.ude.nikaed@ahtiwa (D.W.-D.)
2 Австралійська лабораторія охорони здоров’я тварин (AAHL), Флагман біозахисту, Організація наукових та промислових досліджень Співдружності (CSIRO), 5 Portarlington Road, East Geelong 3219 VIC, Австралія; [email protected]
3 CRC для птиці, P.O. Box U242, Університет Нової Англії, Armidale 2351 NSW, Австралія
4 Кафедра ортопедичної хірургії, Бригам і жіноча лікарня, Гарвардська медична школа, 60 Fenwood Road, Бостон, 02115 MA, США
Дулаші Вітханаге-Дона
1 Нейрологічна дослідницька лабораторія (NARL), Школа наук про життя та навколишнє середовище, Факультет природничих наук, техніки та побудованого навколишнього середовища, Університет Дікін, 75 Pigdons Road, Geelong 3216 VIC, Австралія; ua.ude.nikaed@muhtapd або ude.dravrah.hwb@alapanahdp (P.D.); ua.ude.nikaed@ahtiwa (D.W.-D.)
Мімі Л. К. Тан
5 відділення алергії та імунології, Королівська дитяча лікарня, 50 Flemington Road, Parkville 3052 VIC, Австралія; [email protected]
6 Алергія та імунні розлади, Дитячий науково-дослідний інститут Мердока, 50 Flemington Road, Parkville 3052 VIC, Австралія
7 Університет Мельбурна, Parkville 3010 VIC, Австралія
Тім Доран
2 Австралійська лабораторія охорони здоров’я тварин (AAHL), Флагман біозахисту, Організація наукових та промислових досліджень Співдружності (CSIRO), 5 Portarlington Road, East Geelong 3219 VIC, Австралія; [email protected]
3 CRC для птиці, P.O. Box U242, Університет Нової Англії, Armidale 2351 NSW, Австралія
Ченк Супхіоглу
1 Нейрологічна дослідницька лабораторія (NARL), Школа наук про життя та навколишнє середовище, Факультет природничих наук, техніки та побудованого навколишнього середовища, Університет Дікін, 75 Pigdons Road, Geelong 3216 VIC, Австралія; ua.ude.nikaed@muhtapd або ude.dravrah.hwb@alapanahdp (P.D.); ua.ude.nikaed@ahtiwa (D.W.-D.)
3 CRC для птиці, P.O. Box U242, Університет Нової Англії, Armidale 2351 NSW, Австралія
Анотація
1. Вступ
Виробництво гіпоалергенного Gal d 1 може бути досягнуто за допомогою використання мутагенезу як інструменту у двох різних стратегіях: перша - шляхом мутації послідовностей IgE-зв'язуючих епітопів, а друга - шляхом націлювання на вторинну структуру білків. Дрю та ін. (2004) [19] успішно продукували гіпоалергенний варіант головного латексного алергену Hev b 6.10, порушуючи цистеїн-цистеїнові зв’язки білка для зниження його реакційної здатності IgE. У цьому дослідженні ми успішно створили гіпоалергенний варіант Gal d 1, націлившись лише на два з дев’яти цистеїн-цистеїнових мостів, використовуючи сайт-спрямований мутагенез.
2. Методи
2.1. Сайт-спрямований мутагенез Gal d 1
Нуклеотидна та амінокислотна послідовності Gal d 1. Залишки цистеїну (С) у квадраті в положеннях C192 та C210 є цільовими залишками. Вони були замінені аланіном шляхом мутації нуклеотидів до GCC.
Вторинна структура Gal d 1, що показує загальну кількість містків цистеїну. Дві стрілки показують два містки цистеїну, які будуть зруйновані мутаціями, показаними на малюнку 1. Рисунок адаптовано за матеріалами: Kato et al., 1987 [1].
Таблиця 1
Мутагенна полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) - компоненти основного змішування.
| 10 × QuickChange Lightning Multi реакційний буфер | 2.5 |
| Дводистильована вода | 15.5 |
| Шаблон ДНК | 1 (50 нг) |
| Мутагенні праймери | 1 кожного праймера (100 нг кожного праймера) |
| Суміш дезокси-нуклеозидтрифосфату (dNTP) | 1 |
| Суміш ферментів QuickChange Lightning Multi | 1 |
| Разом | 25 |
Таблиця 2
Мутагенні умови ПЛР.
| 1 | 1 | 95 ° С | 2 хв |
| 2 | 30 | 95 ° С | 20 с |
| 55 ° C | 30 с | ||
| 65 ° C | 3 хв (30 с/кб довжини плазміди) | ||
| 3 | 1 | 65 ° C | 5 |
2.2. Хімічне перетворення в кишкову паличку
2.3. Часова експресія мутанта Gal d 1 для визначення оптимального часу експресії
Єдину колонію мутанта Gal d 1 вирощували протягом ночі в середовищі LB з 50 мкг/мл ампіциліну. Потім культуру протягом ночі пересівали в 10 мл свіжого середовища LB і вирощували до фази середини каротажу (OD600 0,4-0,6). Зразок клітин об’ємом 1 мл гранулювали для використання в якості невираженого контролю (0 год) експресії часового курсу. Потім індукували експресію за допомогою 40 мкл IPTG, і клітини інкубували протягом 6 год при 37 ° С зі струшуванням при 250 об/хв. Зразок по 1 мл збирали кожну годину протягом 6 годин. Гранули, зібрані в моменти часу 0, 2, 4, 5 і 6, лізували з використанням 400 мкл реагенту для лізису Cell Lytic B (Sigma Aldrich, Natick, MA, USA) і центрифугували при 13000 × g протягом 5 хв для відокремлення гранул ( нерозчинна фракція) та супернатант (розчинна фракція). Дві фракції аналізували за допомогою SDS-PAGE та вестерн-блот згідно методів, описаних у Dhanapala et al. 2015 [20].