Імуноферментний аналіз на сендвіч-ферменти для виявлення насіння кунжуту в продуктах харчування

1 Програма досліджень та ресурсів на харчову алергію, Департамент харчової науки та технологій, Університет Небраски, Лінкольн, NE 68588-6207, США

2 Міністерство сільського господарства та сільських справ, Дирекція контролю харчових продуктів та центральних досліджень продовольства, 16036, Бурса, Туреччина

Анотація

1. Вступ

Алергічні реакції на проковтування насіння кунжуту можуть бути спровоковані дозами до 1 мг білка насіння кунжуту для окремих випадків, а дослідження порогової чисельності показало, що приблизно 5 мг білка насіння кунжуту викликає реакцію у 10% насіння кунжуту -алергічне населення [5]. Насіння кунжуту містить декілька алергенних білків, які були ідентифіковані та частково охарактеризовані [6–9]. Кунжутне масло також може представляти небезпеку для осіб, які страждають алергією на насіння кунжуту, оскільки воно часто не є високоочищеним і, отже, містить залишки білка [10].

2. Матеріали та методи

2.1. Препарат імуногену

2.2. Виробництво поліклональних антитіл

Одну козу імунізували 1,0 мг знежиреного імуногену насіння кунжуту, емульгували CFA і вводили підшкірно (с.к.). Перша прискорена ін’єкція, що складається з 500 μг імуногену насіння кунжуту в IFA, вводили через 2 тижні після первинної імунізації. Подальші бустерні ін’єкції вводили по 250 μг знежиреного насіння кунжуту в IFA кожні 3 тижні після цього, чергуючи с.к. і внутрішньом’язово (в/м). Перший тестовий кровотеча був зроблений після другої інжекційної дози (приблизно через 5 тижнів після первинної ін'єкції), а після цього тестові кровотечі були взяті через 10 днів після кожної бустерної ін'єкції.

Три кури спочатку імунізували знежиреним імуногеном насіння кунжуту в CFA, після чого робили прискорені ін’єкції через 2 тижні з використанням 200 μg в IFA (s.c. та i.m., в якості альтернативи) в основному згідно з Schade et al. [15]. Через вісім тижнів після первинної імунізації ця група відпочивала приблизно 6 тижнів, а потім прискорювальні ін’єкції змінили на 3-тижневі інтервали через спостережуване зменшення продукції антитіл.

Розвиток титру моніторили за допомогою неконкурентного ІФА, в основному, як описано Hefle et al. [16]. Коротше кажучи, мікропланшетні пластини (MaxiSorp, Nagle Nunc International, Роскілле, Данія) були покриті 1 μг білка насіння кунжуту/мл буфера для покриття (0,015 М Na2CO3, 0,035 М NaHCO3 та 0,02% NaN3, рН 9,6) та інкубували протягом ночі при 4 ° C. Після блокування 350 μL PBS, що містить 0,1% желатину (свинячий, 300 цвітуть, Sigma Chemical Co., Сент-Луїс, Міссурі), сироватки з жовтків козячих або курячих яєць інкубували в різних розведеннях. Пластини промивали PBS, що містив 0,05% Tween 20, і зв’язаний козячий IgG та яєчний IgY виявляли та визначали кількісно, використовуючи комерційні кон’югати антиімуноглобуліну-лужної фосфатази (анти-козячий IgG [Pierce Chemical Co., Rockford, IL]; IgY [Promega Co., Madison, WI]), відповідно, дотримуючись інструкцій виробника. Кровотеча з кози з титрами понад 10 000 була об'єднана. Жовтки з титрами> 3000 були об'єднані.

2.3. Виділення антитіл

Поліклональні антитіла IgG частково очищали із сироваток шляхом осадження в 50 та 35% сульфаті амонію [16]. Частково очищений IgG короткочасно діалізували проти деіонізованої води, а потім екстенсивно діалізували проти 0,01 М сольового розчину, забуференного фосфатом (PBS) (0,002 M NaH2PO4, 0,008 M Na2HPO4, 0,85% NaCl та 0,02% NaN3, pH 7,4), як описано Hefle et ін. [16]. Ця фракція IgG була використана як покривне антитіло для розвитку ІФА. Імунні яйця збирали і зберігали при 4 ° C до необхідності. Фракцію IgY очищали за допомогою комерційної системи очищення EGGstract IgY (Promega Co., Madison, WI). Препарати імуноглобуліну Y зберігали при -20 ° C до необхідності. Ця фракція IgY була використана як антитіло для виявлення при розробці ІФА. Вміст білка у фракціях IgG (48,5 мг/мл) та IgY (7,7 мг/мл) визначали методом Лоурі [17].

2.4. Гель-електрофорез та імуноблотинг

2.5. Сендвіч ІФА

2.6. Стандартна крива для сендвіч-ІФА

Стандартні криві були побудовані з екстрактами хлібної суміші з додаванням відомих кількостей кунжуту у вигляді кунжутного борошна. Для цього 454 грами сухої хлібної суміші (Hodgson Mills, партія № 10 07 09 2) змішували з необхідною кількістю борошна з насінням кунжуту, щоб досягти 1000 ppm в остаточному рецепті. Ця кількість призведе до концентрації 0,01% або 100 ppm після додавання інших інгредієнтів (загальна вага 742 г). Ще 454 грами сухої хлібної суміші служили негативним контролем. До 454 грам сухої хлібної суміші додавали 30 грамів рослинного масла, 6 грамів свіжих дріжджів і 252 грами води, в результаті чого загальна вага становила 742 грами. Екстракти виготовляли із суміші хліба із колосом 1000 ppm та 0 ppm хліба (як описано нижче), і ці екстракти змішували в різних співвідношеннях для отримання розведень, необхідних для стандартної кривої. Стандартні криві були сформовані за допомогою графічного програмного забезпечення Prism (GraphPad Prism, Inc., Сан-Дієго, Каліфорнія).

2.7. Порівняння з комерційними аналізами насіння кунжуту

Комерційно доступні набори ELISA для насіння кунжуту були отримані від Tepnel Biokits (Deeside, Великобританія) та ELISA Systems (Віндзор, Австралія). Були надані аналізи як готові до використання набори, включаючи всі реагенти, розріджувачі та стандарти, і проводились відповідно до інструкцій виробника. Аналіз Tepnel Biokits мав заявлений діапазон виявлення від 6 до 100 ppm, тест ELISA Systems від 0,5 до 5 ppm. Екстракти готували відповідно до інструкцій виробників наборів.

2.8. Зразки їжі

Всі зразки їжі були придбані у місцевих роздрібних торговців у Лінкольні, штат Небраска. Дев'яносто сім продуктів харчування або харчових інгредієнтів оцінювали на перехресну реакцію та матричні ефекти в ІФА. Усі зразки подрібнювали до однорідної консистенції за допомогою блендера Oster (Oster Professional Products, Чикаго, Іллінойс) або ступки, залежно від текстури зразків.