Інгібування HSP70 обмежує залежне від FAK інвазію та посилює реакцію на лікування меланоми за допомогою

Знайдіть цього автора на Google Scholar
Знайдіть цього автора на PubMed
Шукайте цього автора на цьому сайті
Для листування: [email protected]

Анотація

Вступ

Метастатична меланома є агресивним та, як правило, смертельним злоякісним захворюванням. Розширені меланоми мають кілька онкогенних драйверів, і, незважаючи на досягнення BRAF та інгібітори імунної контрольної точки, стійкість до терапії є значною проблемою (1). Враховуючи неповну ефективність та довговічність сучасних варіантів лікування та величезну схильність меланом до стійкості, існує нагальна потреба у визначенні нових молекулярних мішеней для меланоми. У цій роботі ми перевіряємо гіпотезу про те, що основний індукований стресом білок теплового шоку 70 (також званий HSP72 або HSPA1A, але надалі HSP70) може створити нову терапевтичну перспективу як окремо, так і в поєднанні з сучасними методами лікування.

У цій роботі ми провели перший мікрочип пухлини меланоми для HSP70, використовуючи антитіло, специфічне для основної стресової форми, яка не перехресно реагує з іншими ізоформами (11). Ми показуємо, що HSP70 сильно експресується у великому відсотку меланом, і що експресія цього білка зростає з розвиненою стадією. Ми використовуємо техніку зворотно-фазового масиву білків (RPPA) у меланомах для ідентифікації клітинних білків HSP70 та ідентифікації pFAK та BRAF як двох важливих для меланоми та специфічних клітинних білків HSP70. Ми показуємо, що інгібування pFAK за допомогою інгібітора HSP70 PET-16 призводить до зниження здатності меланом мігрувати, вторгуватися та метастазувати in vivo. Крім того, ми показуємо, що мутантна форма BRAF V600E, присутня у до 50% пухлин меланоми, є клієнтом HSP70. У цьому напрямку ми показуємо, що PET-16 синергізує з інгібіторами BRAF, зберігає цитотоксичність при меланомах, стійких до інгібіторів BRAF, і продовжує тривалість лікування інгібіторами BRAF. Ці комбіновані дані добре свідчать про можливе використання інгібіторів HSP70 для терапії меланоми.

Матеріали і методи

Клітинні лінії, методи лікування та реагенти

Усі клітинні лінії меланоми людини були отримані з колекції Інституту Вістар і підтверджені генотипуванням. Ці клітини підтримували в середовищі MCDB153 (Sigma)/Лейбовіца L-15 (Cellgro) (співвідношення 4: 1), доповненому 2% FCS і 2 ммоль/л CaCl2. Клітини H1299, B16-F10 та фібробласти були отримані з АТСС протягом 6 місяців після їх використання та зберігались у DMEM (Invitrogen). Клітинна лінія FS5, люб'язно надана Ашані Веераратною (Інститут Вістар, Філадельфія, Пенсільванія), підтримувалась в RPMI 1640, а клітинна лінія Yumm1.7 (ласкаво надана Маркусом Бозенбургом, Єльський університет, Нью-Хейвен, штат Коннектикут) DMEM/F12 (Invitrogen). Всі вищезазначені середовища були доповнені 10% FBS (Invitrogen) та 100 ОД/мл пеніциліну та стрептоміцину. На запасах клітин взяли відбитки пальців за допомогою набору AmpFLSTR Identifiler PCR Amplification Kit від Life Technologies в Інституті гестації Інституту Вістар. PET-16 (трифеніл (фенілетиніл) фосфоній бромід; Sigma; каталог № S16773) та вемурафеніб/PLX4032 (S1267; Selleckchem) готували у вигляді 50 ммоль/л вихідних розчинів у ДМСО і зберігали при -80 ° C.

Вестерн-блот, імунопреципітація та РНК

Вестерн-блотинг проводили, як описано (7). Первинні антитіла, використані в цьому дослідженні, включають HSP70 (4873S; Технологія клітинної сигналізації), анти-HA (3724; Технологія клітинної сигналізації), загальний FAK (EMD Millipore; 05-537), FAK Tyr-397-P (44-625G; Invitrogen ), BRAF (sc-5284; Біотехнологія Санта-Крус) та GAPDH (14C10; Технологія сигналізації клітин; 2118). Вторинні антитіла, кон'юговані з пероксидазою хрону, використовували у розведенні 1: 10000 (Імунохімічні продукти Джексона). ECL (Amersham; RPN2232) застосовували до помарок, а рівні білка визначали за допомогою авторадиографії. Кількісне визначення денситометрії білкових сигналів проводили за допомогою програмного забезпечення ImageJ (NIH). Для вестернів ІР 1000 мкг лізату імунопреципітували, як описано (12), 0,5 мкг антисироватки до HSP70, після чого проводили SDS-PAGE, перенесення та Вестерн-аналіз з використанням антисироватки до загальних FAK, FAK Tyr-397-P та BRAF. Клітинна лінія 1205Lu з нокдауном shRNA PTK2/FAK генерується в результаті зараження лентивирусним вектором pLKO.1-puro, що несе будь-яку з двох послідовностей shRNA проти PTK2 людини: shRNA (CCGGTCGAATGATAAGGTGTA; TRCN0000001620 і CAACAGGTGAAGAGCGATTAT; TRCNG. Стабільні клітини відбирали з використанням пуроміцину (1 мкг/мл), а нокдаун PTK2/FAK підтверджувався вестерн-блот.