Кількісна оцінка транслокації Listeria monocytogenes у щурів за допомогою похідних оксиду азоту в сечі
АНОТАЦІЯ
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
Культивування бактерій. L. monocytogenes 4B (клінічний ізолят, B1242 із колекції нашого інституту) звичайно зберігався при -80 ° C у інфузійному відварі серця мозку (Difco, Детройт, Мічиган), що містить 20% (об./Об.) Гліцерину. Вихідні розчини швидко розморожували, висівали на селективні лістерією пластини PALCAM (Merck, Дармштадт, Німеччина), а потім інкубували аеробно при 37 ° C протягом 18 годин. Згодом кілька колоній інокулювали в інфузійний відвар серця мозку, після чого проводили інкубацію протягом ночі при 37 ° С в аеробних умовах. Бактеріальні клітини збирали центрифугуванням (15 хв при 3500 × g), тричі промивали стерильним сольовим розчином і ресуспендували у фізіологічному розчині, що містить 3% (мас./Об.) Бікарбонату натрію. Вірулентність використовуваного штаму підтримувалася звичайним пероральним проходженням у щурів Wistar з подальшим виділенням із селезінки та печінки на 3 день після перорального прийому.
Тварини та інфекція. Експериментальний протокол був затверджений комітетом з питань захисту тварин Університету Вагенінген, Вагенінген, Нідерланди. Самці щурів Wistar (без специфічних патогенів, WU; Harlan, Horst, Нідерланди), віком 9 тижнів з масою тіла приблизно 325 г, були поселені в клітинах з метаболізмом. Температура навколишнього середовища (22 - 24 ° C), відносна вологість (50 - 60%) та цикл темного світла (світло, 0600 - 1800 год) підтримувались постійними. Щурів годували очищеними дієтами, що складалися з 20% казеїну, 63% глюкози, 5% целюлози, 4% кукурудзяної олії та вітамінів та мінералів згідно з рекомендацією AIN-93 (25), за винятком холіну, який додавали у вигляді холіну хлориду замість холіну тартрату та кальцію, який додавали як фосфат кальцію (CaHPO4 · 2H2O; дієта 180 ммоль/кг) замість карбонату кальцію (дієта 125 ммоль/кг). Дієти подавали у вигляді каші з 68% сухої маси (сухі дієти, змішані з подвійною дистильованою водою), щоб мінімізувати пролиття їжі та подальше забруднення сечі та калу. Щури отримали вільний доступ до їжі та демінералізованої питної води. Прийом їжі та маса тіла реєстрували кожні 2–4 дні передінфекції та щоденної постінфекції.
Статистика. Результати виражаються як середнє значення ± стандартні помилки (n = 8). Дані перевіряли на нормальність та однорідність дисперсій за допомогою тесту Шапіро-Вількса та тесту Левена відповідно. При нормальному розподілі відмінності між групами перевіряли дисперсійним аналізом (ANOVA), а потім тестом Стьюдента (одностороннім) з корекцією Бонферроні для множинних порівнянь. В іншому випадку відмінності між групами перевіряли за допомогою непараметричного тесту Крускала-Уолліса. Кореляцію визначали, використовуючи момент продукту Пірсона. Відмінності вважалися значними, якщо ріст Р щурів та споживання їжі. Приріст маси тіла не впливав на введену дозу L. monocytogenes. На початку експерименту середня вага тіла становила 324 г, тоді як середня кінцева маса тіла становила 375 г. На споживання їжі суттєво не впливала введена доза L. monocytogenes. До зараження середнє споживання їжі становило 23,1 г/добу. Після зараження середнє споживання їжі становило 21,1 г/добу.
Колонізація кишечника та транслокація лістерій. Колонізацію кишечника визначали шляхом перерахування життєздатних клітин L. monocytogenes у фекаліях. На рисунку 1 представлена кінетика фекальної екскреції життєздатних L. monocytogenes. На 1 день після щеплення виводився високий рівень лістерії. Виведення L. monocytogenes поступово зменшувалось до межі виявлення протягом 1 тижня після щеплення. Виведення фекалій життєздатного L. monocytogenes залежало від дози. Як і очікувалось, життєздатних L. monocytogenes не вдалося виявити у фекаліях щурів, які отримали 8 × 10 9 теплових бактерій. Клінічних ознак діареї під час перебігу інфекції не спостерігалося.