Кількісне визначення багатих тригліцеридами ліпопротеїдів у здорових чоловіків за допомогою ретинілового ефіру

Від дослідницького відділу атеросклерозу, Науково-дослідний інститут короля Густава V, Медичний факультет, лікарня Каролінська, Інститут Каролінської, Стокгольм, Швеція.

Анотація

Тригліцериди містяться в ліпопротеїнах плазми, щоб забезпечити енергією периферичні тканини. По суті, ліпопротеїн-ліпаза (LPL) гідролізує тригліцериди ядра до вільних жирних кислот або для негайного використання в м’язах, або для зберігання в жировій тканині. Однак іншою стороною медалі може бути накопичення потенційно атерогенних залишкових частинок ліпопротеїдів. 1 Ліпопротеїн дуже низької щільності (ЛНПНЩ), синтезований в печінці людини, має апоВ-100 як основний білковий компонент, на відміну від хіломікронів, що виділяються з кишечника після прийому жиру, у яких апоВ-48 є структурним білком. Два апо-вмісні види ліпопротеїнів поділяють і конкурують за один і той же ліполітичний шлях2, але кишкові тригліцериди, здається, є улюбленим субстратом для ЛПЛ. ApoB-48 у хіломікронах та їх залишках виявляється при дуже низькій концентрації в плазмі як натще, так і після їжі, тоді як VLDL apoB-100 значно зростає після прийому жиру, імовірно через затримку гідролізу. Насправді велика частка ліпопротеїнемії, виявленої після вживання жиру, припадає на ЛПНЩ. 3 4 Однак нещодавно було продемонстровано, що збільшення рівня тригліцеридів ЛПНЩЩ становить лише приблизно 20% тригліцеридів після їжі. 5

Попадання вітаміну А з жиром призводить до мічення ретинілового ефіру хіломікронів. 6 Таким чином, доповнення випробовуваної їжі вітаміном А зазвичай використовується як засіб кількісного визначення ліпопротеїдів кишкового походження в постпрандиальном стані. 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Однак, точність використання вітаміну А в цьому контексті піддається сумніву. 18 Ретинілпальмітат (RP) з’являвся у, мабуть, ендогенних ліпопротеїнах у пізні моменти часу, і пік RP затримувався порівняно з тригліцеридами плазми та піками apoB-48, що спостерігалися після споживання жиру. 18

Методи

Предмети

Здорові чоловіки віком від 35 до 45 років були набрані в рамках опитування населення, що включало 160 суб'єктів північноєвропейського походження. Загалом 129 із 160 чоловіків, з якими звернулися, погодились здати зразки крові для рутинного визначення ліпопротеїнів плазми натще. Щоб дозволити ідентифікувати однорідну групу суб'єктів нормоліпідемії, було проведено фенотипування апоЕ 19, а для фенотипування ліпопротеїнів використовували 90-й процентиль плазмових концентрацій тригліцеридів ЛПНЩ і ліпопротеїдів низької щільності (ЛПНЩ). Після того, як були відібрані суб'єкти, гомозиготні за алелем ε3 з нормальним вмістом тригліцеридів VLDL плазми натще та холестерину LDL (нижче 1,95 та 4,70 ммоль/л, відповідно), залишилось 58 суб'єктів. З них 38 випадково були обрані для цього дослідження та попрошені прийти на пероральний тест на толерантність до жиру. З 38 дев'ять відмовились від участі, а двоє зрештою не змогли взяти участь, що залишило 27 суб'єктів для цього звіту.

Оральне жирове навантаження

Забір крові

Зразки венозної крові відбирали у попередньо охолоджені стерильні пробірки (Vacutainer, Becton Dickinson), що містять Na2EDTA (кінцева концентрація, 4 ммоль/л), які миттєво поміщали у крижану воду та захищали від світла. Потім плазму відновлювали протягом 30 хвилин низькошвидкісним центрифугуванням (1.750g, 20 хвилин, 1 ° C) і витримують при цій температурі протягом усіх процедур підготовки. Фенілметилсульфонілфторид (10 ммоль/л, розчинений у ізопропанолі) та апротинін (1400 мкг/мл) (Трасилол, Байєр) негайно додавали до ізольованої плазми перед фракціонуванням багатих тригліцеридами ліпопротеїдів до кінцевих концентрацій 10 мкмоль/л та 28 мкг/мл відповідно.

Фракціонування ліпопротеїнів

Визначення ApoB-48 та ApoB-100

Визначення RP

Плазма та фракції багатих тригліцеридами ліпопротеїдів були захищені від світла протягом усієї процедури приготування. Обсяги від 100 до 250 мкл плазми та багатих тригліцеридами фракцій ліпопротеїнів екстрагували 4 мл метанолу та 4 мл гексану. Верхню фазу видаляли, і розчинник випаровували слабким потоком N2. Ліпід розчиняли у 200 мкл метанол/хлороформ (3: 1) і вводили у високоефективну систему рідинної хроматографії (System Gold, Beckman). RP елюкували ізократично метанолом, і піки реєстрували за допомогою поглинання УФ при 326 нм. Піки інтегрували із програмним забезпеченням System Gold, і концентрацію визначали за стандартною кривою з п’яти розведень (7,6 - 38 нмоль) високоочищеного RP (Sigma R-3375). Середнє відновлення RP у фракціях порівняно з плазмою становило 89 ± 15% через 3 години та 86 ± 17% через 6 годин. При аналізі одного і того ж зразка у трьох примірниках коефіцієнти варіації становили 1,8% для плазми з високим (6-годинний зразок) та 5,8% для зразка плазми з низьким вмістом RP (9-годинний зразок).

Оборот ліпопротеїдів, мічених RP

Для вивчення обороту мічених RP вміщених тригліцеридів ліпопротеїдів була використана методика, розроблена Берром та Керном 24 25 з незначними модифікаціями. П'ятеро здорових чоловіків вживали змішаний прийом їжі з вітаміном А. Через 4 години проводили плазмаферез, щоб виділити приблизно 0,5 л постпрандіальної плазми, що містить мічені тригліцеридами багаті ліпопротеїди тригліцеридів. Плазмовий мішок зберігали при 4 ° C на піддоні, що повільно струшував, та вводили внутрішньовенно внутрішньовенно через 24 години після плазмаферезу. Випробовуваним було наказано їсти легкий сніданок о 7 ранку, а вливання відбулося о 11 до 11:30 того дня. Інфузію закінчували протягом 4 - 5 хвилин. Зразки крові відбирали до (три зразки протягом 7,5 хвилин) та 1, 2,5, 5, 7,5, 10, 15, 20, 30, 45, 60, 90, 120, 180, 240 та 360 хвилин після закінчення інфузії. Із зразків крові та плазмових мішків виділяли плазму, і визначали концентрацію RP у Sf> 400, Sf від 60 до 400 та Sf від 20 до 60 ліпопротеїнових фракцій, як описано раніше. У таблиці 1 перелічено характеристики п’яти суб’єктів, які проходять плазмаферез та реін’єкцію міченої РП постпрандіальної плазми.

Основні ліпопротеїни плазми

Основні ліпопротеїни плазми натощак (ЛПНЩ, ЛПНЩ та ліпопротеїни високої щільності [ЛПВЩ]) визначали комбінацією препаративного ультрацентрифугування та осадження апоВ-вмісних ліпопротеїдів з подальшим аналізом ліпідів. 26 Загальний рівень холестерину 27 та тригліцеридів 28 визначали у трьох примірниках у плазмі та у фракціях ліпопротеїдів. Спочатку ліпіди екстрагували хлороформом/метанолом. Потім визначали холестерин і тригліцериди на ультралабі (LKB).