Конструювання дріжджів з низьким вмістом етанолу та вина шляхом часткового видалення Saccharomyces cerevisiae

Анотація

Вступ

Матеріали і методи

Штами, середовища та умови зростання

Saccharomyces cerevisiae лабораторні штами BY4741 (гаплоїдні, МАТ a ; his3Δ 1; leu2Δ 0; met15Δ 0; ura3Δ 0) і BY4743 (диплоїдні, МАТ a / МАТ α his3Δ 1/his3Δ 1; leu2Δ0/leu2Δ 0; met15Δ 0/MET15; LYS2/lys2Δ 0; ura3Δ 0/ura3Δ 0) використовувались для побудови мутантів та як контрольних штамів під час експериментів з вініфікацією. Для тестування використовували комерційні винні дріжджі EC1118 (Лаллеманд, Данія) та штатний штам Mab2C, попередньо відібраний у нашій лабораторії. pdc2Δ519 мутація в природних генетичних походженнях. Всі дріжджові штами вирощували при 30 ° C та 150 об/хв у середовищі YPD (2% глюкози, 2% пептону та 1% дріжджового екстракту). YPD, доповнений 200 мг/л G-418, використовували для відбору та обслуговування трансформантів.

Побудова та геномна інтеграція pdc2Δ344 і pdc2Δ519 мутації

Криві зростання в середовищі, багатому на YPD

Дріжджові культури інокулювали в 10 мл YPD і вирощували протягом ночі. Потім ці культури використовували для інокуляції 50 мл YPD у 100 мл колби Ерленмейера при початковій OD600 0,2 (спектрофотометр УФ-видимий T60U PG Instruments, Лестершир, Великобританія). Культури вирощували зі 150 об/хв при 30 ° C, а аликвоти по 100 мкл брали з різними інтервалами для вимірювання OD600.

Лабораторні вініфікації

Статистичний аналіз даних

Тест ANOVA та LSD Фішера зі значенням $ $>> = D ^> \ ліво \> \ ліворуч [\ ліворуч ((\ upmu _> * e)/D \ праворуч) * (\ лямбда-t) +1 \ праворуч ] \ праворуч \> $$

де y = ln (ODt/OD0) OD0 - початковий OD і ODt - OD в момент часу t; D = ln (ODmax/DO0) - максимальна асимптотична крива, μmax - максимальна питома швидкість росту (1/год), λ - період фази відставання (год). Дані про зростання та кінетику встановлювали за допомогою нелінійної процедури регресії, мінімізуючи суму квадратів різниці між експериментальними даними та встановленою моделлю.

Результати

Зростання гаплоїдного та диплоїдного pdc2Δ519 і pdc2Δ344 мутанти в аеробних умовах

низьким

Зростання батьківських та мутантних лабораторних штамів у YPD при 30 ° С та струшуванні 150 об/хв. Кожна точка представляє середнє значення двох незалежних культур

Кількісне визначення параметрів бродіння на основі лабораторних вініфікацій та відбір низького вмісту етанолу pdc2 мутанти

Для того, щоб вибрати низький вміст етанолу pdc2 мутантних штамів, ми провели серію мікровініфікацій з концентрованим суслом, розведеним до 20 ° Bx і доповненим 0,1% (мас./об.) дріжджового екстракту (Vazquez et al. 2001). Визначали концентрацію етанолу, оцтової кислоти, гліцерину та залишкового цукру та розраховували інші похідні ферментативні параметри, такі як баланс вуглецю та вихід глюкози. Ми шукали мутантний штам з незначною неефективністю для отримання етанолу, щоб зменшити вміст алкоголю у вині від 1 до 2% (об/об). Під час першого експерименту з вініфікацією (V1) гаплоїдні та диплоїдні pdc2Δ519 мутанти аналізували на відповідні контролі BY4741 та BY4743 (таблиця 1). Враховуючи виробництво етанолу, BY4741pdc2Δ519 не показав статистичної різниці порівняно з контролем, тоді як BY4743pdc2Δ519 показали статистично значуще зниження етанолу (стор Таблиця 1 Параметри ферментації в лабораторних аналізах вініфікації в білій суслі 20 ° Bx батьківськими та мутантними лабораторними штамами дріжджів