Кріоконсервація дає змогу довгостроково зберігати види, що перебувають під загрозою зникнення, Rubus humulifolius

Анотація

Вступ

Процес і методи кріоконсервації дозволяють довго виживати організмам при температурах рідкого азоту (LN) (- 196 ° C). У зберіганні LN однією з переваг є довгострокове відстрочення витрат на регенерацію. Хоча жодна біологічна проба не є безсмертною, зразки, що перебувають у сховищі LN, матимуть невизначений термін життя (Li and Pritchard 2009). Кріоконсервація єдина ex situ метод збереження для тривалого збереження видів, які неможливо зберігати в банках насіння, напр. клонові культури або види з малою кількістю або непоступливими насінням. Більше того, кріоконсервація, яка вимагає лише мінімальних площ та зусиль на утримання, виявилася дуже важливим інструментом для тривалого зберігання рослинного генетичного матеріалу (Engelmann 2004; Matsumoto 2017).

Найбільш часто використовуваними методами кріоконсервації є вітрифікація, зневоднення інкапсуляції, охолодження з контрольованою швидкістю та збереження сплячих бруньок (Benson 2008; Benelli et al. 2013; Jenderek and Reed 2017). Вітрифікація - це фізичний процес, при якому розчин твердне в метастабільне скло при дуже низьких температурах і дозволяє уникнути кристалізації (Sakai et al. 2008). У багатьох протоколах витрифікації рослин використовуються дві основні техніки: додавання кріозахисних добавок у дуже високих концентраціях та видалення води шляхом випаровування, осушення та осмотичної дегідратації. Кріопротектор діє як антифризна речовина і повинен бути нетоксичним для клітини в концентрації, яка необхідна для її ефективності (Benson 2008).

Rubus humulifolius рослини з популяції Ювяскюля зберігаються in vitro в Ботанічному саду Університету Оулу з 2006 р. (20 рослин, що представляють одну R. humulifolius клон). Останнім часом, R. humulifolius був включений як цільовий вид до проекту ЄС Life + Збереження рідних видів рослин Фінляндії (ESCAPE) (LIFE + 2011 BIO/FI/917 ESCAPE; https://luomus.fi/en/exsitu-conservation-finnish-native -рослина-вид). Під час цього проекту ми розробили протокол кріоконсервації для R. humulifolius щоб забезпечити тривале збереження зародкової плазми окремих популяцій виду.

Матеріали і методи

Рослинний матеріал

Культури мікророзмноження in vitro R. humulifolius C. A. Мейські рослини, що містяться в Біотехнологічній лабораторії ботанічних садів Університету Оулу, були використані як пояснювальний матеріал для цього дослідження. Спочатку рослинний матеріал був отриманий від Інституту природних ресурсів, Фінляндія, де протокол мікророзмноження був розроблений з метою відновлення видів, що представляють найбільш західне середовище існування R. humulifolius (Kypärämäki, Jyväskylä, Фінляндія ETRS-TM35FIN: N 6901644, E 432210).

Вирощування in vitro

Вирощування/підтримка in vitro R. humulifolius рослини проводили на ½ MS (Murashige and Skoog 1962) середовищі з 0,1 мг/л BAP, 0,05 мг/л NAA, 100 мг/л міо-інозитолу, 30 г/л сахарози і 7,6 г/л агару при 22 ° C до 16/8 фотоперіоду. Освітлення забезпечували люмінесцентні лампи (Osram L 30 Вт/830) з інтенсивністю 107–128 мкмоль/м 2/с. Рослини переносили у свіже середовище з інтервалом у 3 місяці.

Протокол кріоконсервації

Для кріоконсервації R. humulifolius, застосовували метод краплинного скловиділення. У цьому дослідженні кріоконсервацію проводили, як у протоколі інкапсуляції вітрифікації, спочатку розробленому для малини (Rubus idaeus), але без етапу інкапсуляції (Wang et al. 2005). Ми вивчали ефект 10-денної попередньої обробки абсцизовою кислотою або без неї (0, 2 або 4 мг/л АБК), проведеної на 1-місячних бруньках, розсічених з безлічі пагонів рослин in vitro. Для контролю протокол кріоконсервації (див. Нижче) застосовували відразу після розсічення (лікування 1 у таблиці 2). Ми також вивчали вплив інтервалу розповсюдження на успішність кріоконсервації R. humulifolius. Бутони були зібрані з 1-, 2- або 4-місячних рослин-донорів (з останньої субкультури), пізніше названих віком in vitro. Усі експерименти/обробки включали некриоконсервовані контрольні бруньки (оброблені як кріоконсервовані, але без заморожування в LN), і всі робочі етапи під час процедури кріоконсервації проводились асептично. Бутони в кожній обробці мали по три повторення (три пластинки Петрі/обробка), і експеримент проводився один раз.

Для кріоконсервації бруньки (розміром 2–4 мм), з попередньою обробкою або без неї, спочатку попередньо культивували на середовищі MS з 0,1 мг/л BAP, 0,05 мг/л NAA, 100 мг/л міо-інозитолу, включаючи 0,25, 0,5 і 0,75 М сахарози протягом однієї доби на концентрацію (рис. 1а). Після цього бруньки переносили в завантажувальний розчин (0,75 М сахарози, 2 М гліцерину, ½ МС) протягом 90 хв. Після цього бруньки заскрічували в розчині для склозатискання рослин 2 (PVS2: 30% гліцерину, 15% етиленгліколю, 15% ДМСО, 0,4 М сахарози в ½ мс) протягом 3 год. Інкубації в завантажувальному розчині та PVS2 проводили шляхом розміщення бруньок на невеликих пластинах Петрі, змочених по 2 мл кожного розчину за раз. Стадії попереднього культивування, завантаження та скловиділення проводили при кімнатній температурі (RT). Після кріозахисту в PVS2 шматки алюмінієвої фольги (0,5 × 1,5 см) готували з 2–3 мкл крапель PVS2 (рис. 1b), а бруньки переносили до крапель (5 на фольгу) і кріоконсервували, швидко переносячи фольги в кріотрубки, заповнені рідким азотом (LN), принаймні на 1 год.

a. Rubus humulifolius бруньки після обробки сахарозою. . Фольговані смужки з краплями PVS2. c. Відновлюється брунька через 2 тижні після кріоконсервації. d. Кріоконсервований матеріал через 2 місяці після кріоконсервації. e. Кріоконсервований матеріал через 2 тижні після переведення в умови ex vitro. f. Кріоконсервована зимувала R. humulifolius рослини

Відновлення після кріоконсервації

Перший крок до відновлення кріоконсервованих R. humulifolius buds розморожував кріотрубки при водяній бані при 40 ° C протягом 3 хв. Після цього кріотрубки розкривали і фольги з бруньками переносили в 30 мл розвантажувального розчину (1 М сахароза в ½ мс) при RT. Після цього надлишок вологи видаляли перенесенням на фільтрувальний папір і бруньки культивували на середовищі МС з 0,1 мг/л ПДК, 0,05 мг/л НАА, 100 мг/л міо-інозитолу і 30 г/л сахарози в Петрі. тарілки протягом 4 днів у темряві перед перенесенням на світло в кімнату для культури. Виживання (S) та регенерація (R) бруньок оцінювались у декілька часових точок (від 1 до 5 тижнів) під стереомікроскопом. Бутони, класифіковані як вижилі (S), включали як відроджувальні бруньки (R), тобто бруньки, що утворюють нові пагони (рис. 1в), так і бруньки, які були живими, але не відроджуються.