Лікування розиглітазоном відновлює функцію рецепторів дофаміну в нирках при гіпертонії щурів із цукером із ожирінням

З Інституту серця та нирок, Фармацевтичний коледж, Університет Х'юстона, Х'юстон, Техас.

З Інституту серця та нирок, Фармацевтичний коледж, Х'юстонський університет, Х'юстон, Техас.

Ви переглядаєте останню версію цієї статті. Попередні версії:

Анотація

Усередині нирки рецептори дофаміну, що знаходяться в проксимальних канальцях, відіграють важливу роль у регулюванні виведення натрію та води в різних фізіологічних умовах. 1 Дофамінові рецептори існують як на апікальній, так і на базолатеральній стороні проксимального канальця. 2 З рецепторів дофаміну, наявних у проксимальних канальцях, підтип D1 пов’язаний із опосередкованим дофаміном натрійурезом та діурезом. 3 На рівні клітинного механізму дії рецептори D1 через зв'язування з білками Gs та Gq пов'язані з аденилілциклазою та фосфоліпазою C. 4-6 Активація рецепторів D1 та подальша стимуляція шляхів другого вісника призводять до інгібування транспортерів натрію - Na/H-обмінник (NHE) та Na, K-ATPAase (NKA) - і, отже, збільшення ниркової екскреції натрію. 4,7–9

Численні повідомлення показали, що натрійуретична реакція на екзогенно влитий або ендогенно продукований дофамін притупляється у спонтанно гіпертонічних щурів (SHR), 10,11 через дефект D1-рецепторів у проксимальних канальцях. 12 Дослідження in vitro показують, що дофамін не інгібує NKA та NHE у проксимальних канальцях SHR. 13,14 Недавнє дослідження, проведене в первинних епітеліальних клітинах проксимальних канальців, отриманих з нирок гіпертонічної хвороби людини, виявило гіперфосфорилювання рецептора D1, спричиненого гіперактивним GRK4, як механізм дефектних рецепторів D1. 15 Дефект рецептора D1 виправляється після зниження регуляції GRK4 шляхом обробки специфічним антисенсом GRK4. 15

Подібним чином нещодавно ми повідомляли, що дофамін не здатний пригнічувати активність NKA та NHE у проксимальних канальцях щурів Цукера із ожирінням. 16,17 Однак, на відміну від спостережень, проведених у SHR, кількість рецепторів D1 як на базолатеральній (BLM), так і на мембрані щіткової мембрани (BBM) зменшилася на 50% у людей із ожирінням порівняно з негустими контрольними щурами. 16,17

Щур Цукера з ожирінням є моделлю гіперінсулінемії та діабету 2 типу. 18 Показано, що інсулін впливає на клітинну функцію різних гормонів, змінюючи кількість рецепторів або чутливість рецепторів до їх лігандів. 19–21 Повідомлялося, що у хворих на цукровий діабет 2 типу натрійуретична реакція на екзогенний дофамін була знижена. 22 На підставі цих досліджень ми висунули гіпотезу про те, що зменшення кількості рецепторів D1 та нездатність дофаміну інгібувати транспортери натрію у ожирілих щурів Цукера могли бути спричинені хронічною гіперінсулінемією, яка у разі коригування може призвести до відновлення кількості рецепторів D1 та його функціонують у ожирілих щурів. Тому в цьому дослідженні ми лікували повних щурів Цукера розиглітазоном, тіазолідиндіоном, який, як було показано, знижує рівень інсуліну в плазмі крові, покращуючи чутливість до інсуліну. 23,24 Після лікування розиглітазоном вимірювали кількість рецепторів D1 та вплив дофаміну на активність NKA в проксимальних канальцях щурів із ожирінням. Крім того, були проведені додаткові експерименти в первинних епітеліальних клітинах для вивчення впливу інсуліну на регуляцію D1 рецептора в більш контрольованих експериментальних умовах.

Методи

Тварини та медикаментозне лікування

Вісім - 9-тижневих самців ожирілих щурів Цукера та відповідних за віком самців худорлявих щурів Цукерів (Harlan Sprague-Dawley Inc) утримували у пластикових клітинах та годували звичайною чау-гризучою водою та водопровідною водою. Щурів з ожирінням поділяли на дві групи: щурів, які страждали ожирінням, та щурів, що страждали ожирінням, які отримували розиглітазон. Лікувальна група отримувала розиглітазон малеат (10 мг/кг), суспендований у 1% карбоксиметилцелюлозі в дистильованій воді перорально протягом 4 тижнів. Контрольна група з ожирінням отримувала 1% карбоксиметилцелюлози. Худі щури Цукера не отримували лікування. Кожна група складалася з 6 щурів.

Загальні та біохімічні параметри

Масу тіла реєстрували на початку та в кінці лікування. В кінці лікування щурів поміщали в клітини з метаболізмом на 24 години з вільним доступом до води. Зразки сечі збирали та аналізували на вміст натрію та калію в сечі за допомогою полум'яної фотометрії (полум'яний фотометр Corning 480). Для вимірювання артеріального тиску щурів знеболювали пентобарбіталом натрію (50 мг/кг маси тіла IP). Після того, як було зроблено розріз середньої лінії, аорту катетеризували нижче нирок і вимірювали артеріальний тиск за допомогою датчика тиску Statham і реєстрували на поліграфі трави протягом 30 хвилин. Зразки крові відбирали з аорти в пробірках, покритих ЕДТА, для вимірювання рівня глюкози в крові та інсуліну в плазмі крові. Глюкозу в крові вимірювали за допомогою аналізатора глюкози (Roche Diagnostic Inc). Інсулін у плазмі крові вимірювали радіоімуноаналізом із комерційним набором.

Виділення та збагачення проксимальних канальців

Після вимірювання артеріального тиску та відбору зразків крові щурів використовували для підготовки проксимальних канальців нирок, як ми вже описали раніше. 14 Білок вимірювали за допомогою набору (Пірс).

Na, аналіз K-ATPase

Проксимальну канальцеву суспензію (1 мг білка/мл) у буфері Кребса інкубували з дофаміном або без нього (від 1 нмоль/л до 1 мкмоль/л) при 37 ° С протягом 20 хвилин. Після інкубації канальці проникли швидким заморожуванням у сухому льоду/ацетоні та розморожуванням. Чутливу до уабаїну активність Na, K-АТФази вимірювали 14 (виражали як нмоль Пі/мг білка на хвилину).

Підготовка мембрани

Проксимальні канальці гомогенізували в буфері, що містить (ммоль/л) 10 трис-HCl, 250 сахарози, 0,2 фенілметилсульфонілфториду, коктейль інгібітора протеази при pH 7,6, і центрифугували при 2500 g протягом 10 хвилин. Супернатант центрифугували при 24000g протягом 20 хвилин. Верхній пухнастий шар гранул ресуспендували в тому ж буфері, пропускали і знову центрифугували при 24000g протягом 20 хвилин. Гранули промивали промивним буфером, що містить 100 KCl, 100 манітолу, 5 (-[2-гідроксиетил] піперазин-′ - [2-етансульфонова кислота]), рН 7,2, і центрифугують при 34000g протягом 30 хвилин. Нарешті, мембранну фракцію (що містить як BBM, так і BLM) ресуспендували в невеликому обсязі буфера гомогенізації та зберігали замороженою для подальшого використання.

[3 H] SCH 23390 Зв’язування

Зв'язування [3 H] SCH 23390 з проксимальними трубчастими мембранами проводили згідно з описаним раніше способом. 4,16 Для отримання ізотерми насичення концентрацію ліганду варіювали від 1 до 60 нмоль/л. Для визначення неспецифічного зв'язування використовували холодний SCH 23390 (10 мкмоль/л). Конкретні дані зв'язування використовувались для визначення Bmax та Кd значення.