Метформін підвищує активність АМФ-активованої протеїнкінази в скелетних м’язах суб’єктів із типом

Анотація

Метформін є одним із найбільш часто використовуваних препаратів для лікування діабету 2 типу. Це ефективний гіпоглікемічний препарат, який також покращує ліпідні профілі (1) та зменшує серцево-судинний ризик (2). Програма профілактики діабету нещодавно показала, що подібно до дієти та фізичних вправ лікування метформіном знижує ризик розвитку діабету у осіб, які не переносять глюкозу (3). У той час як більшість досліджень показали, що знижуючі глюкозу ефекти метформіну є вторинними внаслідок зменшення вироблення печінкової глюкози (1,4–6), значний масив даних також свідчить про те, що цей препарат збільшує розподіл глюкози в скелетних м’язах (1,7, 8); однак його молекулярне місце дії залишається незрозумілим.

амф-активованої

АМФ-активована протеїнкіназа (AMPK) - це гетеротримерний фермент, що складається з каталітичної субодиниці (α) та двох регуляторних субодиниць (β та γ) (9,10). Існує дві ізоформи каталітичної субодиниці: AMPK α1, яка широко поширена, і AMPK α2, яка експресується в скелетних м’язах, серці та печінці (11). AMPK працює як внутрішньоклітинний індикатор палива, який активується зниженням співвідношення АТФ/АДФ та фосфокреатину (PCr)/креатину через механізми, що передбачають фосфорилювання однією або кількома кіназами AMPK вище, аллостеричну активацію та зменшення інгібуючої дії фосфатаз ( 9,12, 13). Збільшення активності AMPK призводить до стимуляції засвоєння глюкози в м’язах, окиснення жирних кислот у м’язах та печінці та пригнічення вироблення печінкової глюкози, синтезу холестерину та тригліцеридів та ліпогенезу (14).

Хімічна активація AMPK із з'єднанням 5-аміноімідазол-4-карбоксамід рибонуклеозид (AICAR) призводить до збільшення поглинання глюкози (15–19) та посилення чутливості до інсуліну в м’язах (20, 21). AICAR не може стимулювати поглинання м’язової глюкози у мишей, які несуть у м’язах мутанта AMPK, що загинув від кінази (19). У клітинах печінки активація AMPK за допомогою AICAR спричиняє пригнічення вироблення глюкози (22–24). На основі цих подібностей між метаболічними ефектами AICAR та метформіну в печінці та м’язах, ми раніше перевірили можливість того, що AMPK міг брати участь у опосередкуванні метаболічних дій метформіну в тканинах тварин (25). Метформін суттєво підвищував активність AMPK у культивованих гепатоцитах щурів та ізольованих м’язах, і, що важливо, активація ферменту була пов’язана зі зменшенням вироблення глюкози гепатоцитами та вищим поглинанням глюкози в м’язах (25). Щоб дослідити, чи активація AMPK метформіном є ймовірним механізмом його метаболічних ефектів у хворих на цукровий діабет 2 типу, у цьому дослідженні ми дослідили, чи лікування цим препаратом змінює активність ізоформ AMPK α1 та α2 в скелетних м’язах.

ДИЗАЙН ДИЗАЙН І МЕТОДИ

Предмети.

Вісім пацієнтів з діабетом 2 типу (сім чоловіків та одна жінка) були вивчені до, під час та після 10 тижнів лікування метформіном. Дослідження було схвалено Етичним комітетом при Інституті Каролінської. Випробовуваних інформували про мету дослідження та потенційні побічні ефекти препарату. Письмова згода була отримана від усіх випробуваних. Діагноз діабету 2 типу був поставлений лікарями обстежених на основі опублікованих критеріїв (26). Креатинін сироватки та амінотрансферази вимірювали на початковому рівні, щоб виключити триваючі захворювання нирок або печінки. Троє випробовуваних приймали сульфонілсечовину, два метформіну та троє - комбінацію обох препаратів. Суб'єктів виключали, якщо вони мали будь-які системні захворювання (крім діабету) або приймали будь-який інший препарат, який, як відомо, впливає на метаболізм вуглеводів у м'язах.

Протокол дослідження.

Аналіз активності AMPK та імуноблотинг.

Зразки м’язів гомогенізували, як описано раніше (29), а лізати використовували для визначення активності AMPK та імуноблотингу. Активність AMPK визначали після імунопреципітації білка 200 мкг із використанням специфічних антитіл, виготовлених проти амінокислотних послідовностей 339–358 AMPK α1 та 352–366 α2, як описано раніше (29). Реакцію проводили з використанням синтетичного пептиду HMRSAMSGLHLVKRR як субстрату (30). Активність AMPK виражається у вигляді включеного АТФ (пікомолі) на міліграм білка на хвилину. Імуноблотинг проводили, як описано раніше (29). Коротко кажучи, білки (60 мкг) з м’язових лізатів відокремлювали 8% SDS-PAGE і переносили в мембрани нітроцелюлози. Після блокування мембрани інкубували протягом ночі при 4 ° C з антитілом проти AMPK α2, описаним вище (3 мкг/мл), або з анти-фосфо-AMPK (Thr172) (3 мкг/мл; Cell Signaling, Beverly, MA). Зв’язані антитіла виявляли за допомогою цілих антитіл до кролячих імуноглобулінів та пероксидази хрону та за допомогою посилених хемілюмінесцентних (ECL) реагентів (NEN Life Science Products, Бостон, Массачусетс). Мембрани піддавали дії плівки, а смуги кількісно визначали за допомогою програмного забезпечення ImageQuant (Molecular Dynamics).