Методи очищення білка; Новини-Медичні
Технології білкової інженерії є важливою частиною налаштування або отримання білків зі специфічними властивостями, які можуть застосовуватися в різних промислових процесах. Таким чином, вони мають вирішальне значення для біотехнологічних досліджень.
Однак ці методи в значній мірі залежать від можливості виділення та очищення бажаних білків, щоб можна було зрозуміти їх фізичні та хімічні властивості, а також їх третинну структуру та взаємодію з лігандами та субстратами.
Інтенсивність, до якої здійснюється цей процес очищення, залежить від того, як застосовувати білок. Наприклад, фармацевтичні та харчові білки потрібно довести до високого ступеня чистоти і пройти кілька послідовних етапів, якомога менше, оскільки на кожному етапі частина білка неминуче втрачається.
Очищення молекул білка простіше, ніж очищення білкових комплексів.
Крок 1: Створення сирого екстракту білка
Сирі екстракти внутрішньоклітинних білків готують шляхом лізису клітини за допомогою хімічних або механічних процесів. Потім сміття видаляють центрифугуванням. Отриманий супернатант є далеко не чистою формою і змішується з багатьма іншими макро- та мікромолекулами.
Позаклітинні білки отримують шляхом центрифугування розчину та видалення клітин. Конкретним методом отримання сирого екстракту термостабільних ферментів є нагрівання суміші з метою денатурації інших білків, а потім охолодження для реформування цікавих термостабільних білків, нарешті, центрифугування для видалення денатурованих білків.
Крок 2: Проміжне очищення
Соління
Потім білки в неочищеному екстракті очищають шляхом осадження їх у висококонцентрованому розчині солі, такому як сульфат амонію. Це працює на основі меншої розчинності білка при високих концентраціях солі. Однак усі білки не випадають в осад при однаковій концентрації солі, а це означає, що соління також допомагає фракціонувати білки. Також його можна використовувати для концентрування білків у розчині. Цей етап збільшує чистоту втричі, і 92% білка в розчині відновлюється.
Діаліз
Білки - це великі молекули, і це означає, що солі білків будуть утримуватися, пропускаючи розчин через напівпроникну мембрану. Целюлоза - типова діалізна мембрана. Діаліз не можна використовувати для розділення білків з різною молекулярною вагою.
Хроматографія
Інші методи, що застосовуються для видалення засолених білків, включають гель-хроматографію та фільтрацію. Зараз вони доступні як готові набори для багатьох стандартних білків і часто підходять для широкомасштабних процесів.
Гель-фільтрація працює на основі поділу розмірів через колонку з пористих полімерних гранул, таких як декстран або агароза. Великі молекули можуть протікати лише через проміжки між намистинами, тоді як менші займають і ці простори, і простір усередині намистин, сповільнюючи їх. Таким чином, елюенти містять молекули, що виникають у порядку їх розміру, від найбільшого до найменшого. Також застосовуються зворотно-фазові або іонообмінні методи хроматографії, що діють на основі диференціальних гідрофобних властивостей і заряду відповідно. Хроматографія із зворотною фазою може бути обмежена у застосуванні через можливу денатурацію білка органічними розчинниками.