Молекулярний аналіз дієтичного різноманіття для трьох архаїчних корінних американців PNAS

Передано Патті Джо Ватсон, Університет Вашингтона, Сент-Луїс, Міссурі (отримано на огляд 22 червня 2000 р.)

молекулярний

Анотація

ДНК була вилучена з трьох зразків калу віком понад 2000 років із печери Hinds, штат Техас. Ампліфікація послідовностей мтДНК людини показала їх приналежність до сучасних корінних американців, тоді як послідовності антилопи вилорогих, овець великої роги та кролика бавовняного хвоста дозволили ідентифікувати цих тварин як частину раціону цих особин. Крім того, ампліфікація послідовностей ДНК хлоропласту ідентифікувала вісім різних рослин як елементи харчування. Ці архаїчні люди за короткий проміжок часу споживали 2–4 різних видів тварин та 4–8 різних видів рослин. Швидкість отримання ДНК з палеофекацій сильно контрастує з показником із скелетних решток, де рівень успіху, як правило, низький. Отже, людські палеофекальні рештки представляють джерело древньої ДНК, яка значно доповнює і в деяких випадках може перевершувати джерело скелетної тканини.

ДНК, витягнута з екскрементів, що залишилися нині вимерлими тваринами, дозволяє їх ідентифікувати та генетично вивчити, а також розкриває аспекти їх раціону (1). Велика кількість древнього фекального матеріалу передбачуваного людського походження також виявляється під час археологічних розкопок, особливо в сухих печерах та скельних укриттях. Однією з таких ділянок є печера Hinds, розташована на східному краю пустелі Чихуахуань на південному заході Техасу, де під час розкопок у 1974 році було виявлено понад 1000 передбачуваних відкладень людських калових мас (2).

Щоб дослідити, чи можна використовувати такий матеріал для вивчення послідовностей ДНК у стародавніх людей та з їжі, яку вони поглинали, ми проаналізували молекулярний склад та збереження ДНК для трьох зразків палеофекалу (тут пронумеровані I-III) (рис. 1). Результати показують, що послідовності ДНК з дефекаційних особин, а також з рослин та тварин, споживаних ними, можуть бути отримані. Аналіз цих послідовностей дозволяє визначити приналежність населення до мтДНК людей, а також надає інформацію про їх дієти.

Людські палеофецеси з печери Hinds, штат Техас. [Масштаб, 1 см на фотографії дорівнює 2,78 см реального (слайд).]

Матеріали і методи

Експериментальні процедури.

Щоб оцінити рівень біомолекулярної збереженості перед аналізом ДНК, ми проаналізували зразки за допомогою піролізної газової хроматографії/МС, як це було зроблено на попередніх зразках копроліту (1). Приблизно 15 мг мелених палеофекальних зразків піролізували та аналізували за допомогою піролізно-газової хроматографії/МС, як описано для зразків кісток (3).

ДНК витягували один раз із усіх зразків, як описано (1). Крім того, проводили по одній екстракції зразків I та II із наступними модифікаціями. Два-три грами висушеної палеофекальної речовини протягом 5 днів регідратацію проводили в темряві в скляному ексикаторі, що містив відкриту 500-мілілітрову пляшку подвійної дистильованої води, якій дозволяли випаровуватися за допомогою смужки фільтрувального паперу ватмана води і один кінець на зовнішній стороні пляшки. Відносна вологість повітря в ексикаторі досягла плато 92% до другої доби. Після регідратації зразки поміщали в 50-мл пробірки Falcon, що містять 10 мл екстракційного буфера хлориду літію (0,1 М Tris⋅Cl, рН 7,2/10 мМ ЕДТА, рН 8,0/0,5 М LiCl/1% додецилсульфату літію/50 мМ ДТТ/200 мкг/мл протеїнази К), яку обертали протягом ночі при 37 ° С. Додавали п’ять мілілітрів 4% цетилтриметиламмонійброміду, 2% полівінілпіролідону і знову обертали протягом ночі при 37 ° С. З цієї суміші витягували 1 мл, як описано (1), а решту заморожували при -20 ° C для подальшої екстракції. Додаткову екстракцію ДНК зразка III для незалежної реплікації проводили в Оксфорді, як описано (1).

Ампліфікацію ПЛР проводили, як описано (4), використовуючи праймери, перелічені нижче, для трьох сайтів рестрикції (HaeIII, HincII та AluI), повтору 9-bp, гіперваріабельної області I, генів рРНК 12S та 16S та гена rbcL хлорпласту: L00635 5′-TGAAAATGTTTAGACGGCCTCACATC-3 ′; H00708, 5′-TAGAGGGTGAACTCACTGGAAC-3 ′; L13259, 5′-AATCGTAGCCTTCTCCACTTCA-3 ′; H13377, 5′-TATCTTGTTCATTGTTAACGTTGTGG-3 ′; L05054, 5′-TAGGATGAATAATAGCAGCTCTACCG-3 ′; H05184, 5′-GGGTGGATGGAATTAAGGGTGT-3 ′; L09158, 5′-ATACTACGGTCAATGCTCTG-3 ′; H09297, 5′-ATGCTAAGTTAGCTTTACAG-3 ′; L16131, 5′-CACCATGAATATGTACGGT-3 ′; H16218, 5′-ATGTGTGATAGTTGAGGGTTG-3 ′; L16209, 5′-CCCCATGCTTACAAGCAAGT-3 ′; H16303, 5′-TGGCTTTATGTACTATGTAC-3 ′; L16287, 5′-CACTAGGATACCAACAAACC-3 ′; H16379, 5′-CAAGGGACCCCTATCTGAG-3 ′; 12Sa ′, 5′-CTGGGATTAGATACCCCACTAT-3 ′; 12Так, 5′-GTCGATTATAGGACAGGTTCCTCTA-3 ′; 16S6, 5′-TTTCGGTTGGGGCGACCTCGGAG-3 ′; 16S7, 5′-TTGCGCTGTTATCCCTAGGGTAACT-3 ′; rbcLZ1, 5′ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGCAAGT-3 ′; rbcL19b, 5′CTTCTTCAGGTGGAACTCCAG-3 ′ та rbcL19, 5′-AGATTCCGCAGCCACTGCAGCCCCTGCTTC-3 ′.

Ампліфікації частин гіперваріативної області проводили двічі для всіх зразків для виявлення заміщень внаслідок дезінкорпорацій нуклеотидів, які можуть бути присутніми у всіх клонах, коли ампліфікації починаються з декількох або з окремих матричних молекул (5). Всі продукти ампліфікації клонували у вектори клонування ТА (Invitrogen) відповідно до інструкцій виробника, як описано (5). ПЛР колонії проводили, як описано (6). Секвенування проводили за допомогою набору для секвенування циклу (Amersham Pharmacia) відповідно до інструкцій виробника.

Ідентифікація рослин.

Загалом було секвенировано 111 клонів rbcL. Оскільки нуклеотидні відмінності, наявні лише в одному клоні, ймовірно, є результатом дезінкорпорацій нуклеотидів під час ПЛР, консенсусні послідовності кожної групи споріднених послідовностей були прийняті для представлення послідовності певної рослини, присутньої в палеофекальному зразку. Ці послідовності були таксономічно ідентифіковані, як описано (1), за допомогою програми blastn (20 січня 2000 р.). Відзначено сім'ї та замовлення, які відповідають 0 та/або 1 невідповідності. Там, де лише одна сім'я відповідала послідовності, ця сім'я вважалася правильною, коли дві або більше сімей з одного порядку відповідали, порядок вважався правильним. П’ять клонів, які не можуть бути пов’язані з будь-яким кластером послідовностей та відповідними записами бази даних із більш ніж двома різницями, були визнані неідентифікованими. Нарешті, два однакових клони з зразка II (див. Рис. 3, позначений *) несли одну різницю для двох сімейств із порядку Zingiberales. Члени цього порядку не пристосовані ні до посушливих, ні до континентального клімату, отже, найпростішим поясненням цієї знахідки є помилкова ідентифікація, ймовірно, тому, що в базі даних не присутній представник правильної родини.

Ідентифікація тварин.

Для ідентифікації нелюдських послідовностей хребетних в ампліконах 12S та 16S рРНК, що кодують ДНК (rDNA), ми клонували продукти ПЛР та відфільтровували клони за допомогою ПЛР колонії, використовуючи прямий та зворотний праймери М13 з додаванням третього, специфічного для людини праймера. (12SA′H 5′-GCCCTAAACCTCAACAGTTAAATC-3 ′ та 16S6H 5′-ACCAGTCAAAGCGAACTACTATAC-3 ′ відповідно). Всі ПЛР-продукти, що демонструють продукт ампліфікації очікуваної довжини для відповідної вставки, але не показавши коротший продукт ампліфікації людини, були послідовно розподілені. В результаті скринінгу 68 клонів 12S рДНК із зразка I отримано три нелюдських клони; тоді як нелюдських клонів не виявлено серед 64 клонів 12S рДНК із зразка II, а також серед 33 та 28 клонів 16S рДНК із зразків I та II відповідно. Послідовності порівнювали з послідовностями GenBank за допомогою blastn (20 січня 2000 р.). Сім'ї, які відповідають 0 та 1 невідповідності, були відзначені разом із наступним найближчим збігом, і ідентифікація проводилася, коли одна (і лише одна) сім'я відповідала 0 та 1 невідповідності.