Накопичення крапель ліпідів у гідроксилимонній кислоті через зменшення надходження ацетил-коа і
Ключова лабораторія фізіології та біохімії тварин Коледжу ветеринарної медицини,
Нанкінський сільськогосподарський університет, Нанкін, (Китай)
Тел. (+86) 25-8439 6763, факс (+86) 25-8439 8669, електронна пошта [email protected]
Статті, пов’язані з "
- Електронна пошта
Анотація
Автор (и). Опубліковано S. Karger AG, Базель
Вступ
Ожиріння є однією з найбільших загроз для здоров'я людини, і зростаюча проблема ожиріння пов'язана з множинними захворюваннями [1], включаючи підвищений ризик діабету, серцево-судинних захворювань, гіпертонії, серцевих захворювань та жирової хвороби печінки [2-5]. Ці хвороби вражають мільйони людей, які повинні ретельно контролювати рівень глюкози в крові, щоб запобігти ускладненням, пов’язаним з діабетом [6, 7]. Біологія ожиріння дуже складна, і механізми, що пов'язують ожиріння з різними захворюваннями, недостатньо вивчені [2]. Багато уваги було зосереджено на використанні різних біоактивних сполук для контролю ожиріння [8], тоді як більшість з цих досліджень досліджують вплив факторів, пов’язаних з метаболізмом ліпідів, на контроль накопичення жиру у тварин та людей [7, 9-12]. Останнім часом зростає стурбованість ожирінням, пов'язаним із метаболізмом глюкози [13-15].
(-) - Гідроксилимонна кислота (HCA) є основним діючим інгредієнтом, що присутній у шкірці плодів Гарцинії камбоджійської [16-18]. Попередні дослідження повідомляли, що (-) - HCA збільшує втрату ваги [19, 20], сприяє витраті енергії [21-23], збільшує швидкість синтезу глікогену [24] і пригнічує de novo синтез жирних кислот [25-27]. Нещодавно наша лабораторія виявила, що (-) - лікування HCA сприяло синтезу білка та збільшувало витрати енергії у самців щурів [28]. Крім того, ми також виявили, що (-) - HCA інгібує синтез жирних кислот за рахунок зменшення надходження ацетил-CoA через сприяння циклу лимонної кислоти та пригнічення експресії залежного від НАДФ яблучного ферменту у курчат-бройлерів [29]. Крім того, попередні дослідження показали, що (-) - HCA є потужним конкурентним інгібітором АТФ-цитрат-ліази [25, 26, 30-32], цитозольного (позамітохондріального) ферменту, який каталізує розщеплення цитрату до оксалоацетату та ацетилу -CoA, що врешті-решт обмежує доступність одиниць ацетил-CoA, необхідних для синтезу жирних кислот та ліпогенезу у тварин та людей [21, 33].
(-) - HCA за структурою схожий на цитрат. Цитрат є алостеричним регулятором ряду ферментів, які беруть участь у вуглеводному та жировому обміні, таких як фосфофруктокіназа (фермент, що регулює гліколіз) [33] та ацетил-КоА карбоксилаза (фермент, що регулює синтез жирних кислот) [34]. Повідомлялося, що (-) - HCA має набагато більшу спорідненість до цитратної ліази, ніж до цитрату [22, 35]. Таким чином, (-) - добавки HCA, як очікується, змінять метаболічні шляхи. Хоча деякі дослідження показали (-) - HCA володіє активністю до ожиріння [36, 37] та антидіабетичною активністю [38, 39], мало інформації про те, чи впливає (-) - HCA на накопичення жиру у курчат-бройлерів шляхом регулювання на енергетичний обмін.
На відміну від видів ссавців, печінка є найважливішим органом Росії de novo синтез жирних кислот [35, 40] та енергетичний обмін [41] у птиці. Отже, це дослідження було проведено для вивчення впливу (-) - HCA на ліпідний обмін та енергетичний обмін у культивованих первинних курячих гепатоцитах, що надасть корисну інформацію для подальшого розуміння біохімічних механізмів, пов'язаних з регулюванням накопичення жиру за допомогою ( -) - HCA у курчат-бройлерів.
Матеріали і методи
Реагенти
(-) - гідроксилимонна кислота (HCA) була отримана з еталонного стандарту USP (США). Всі набори ELISA для курки були придбані у Shanghai Hengyuan Biological Technology Co. (Китай). Medium 199 був придбаний у лабораторіях Hyclone (Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США); МТТ, трансферин, трипсин, пеніцилін та стрептоміцин були придбані у Sigma (США). Глютамін та HEPES були отримані від Amresco (Solon, OH, США); Набір реактивів TRIZOL був придбаний у Invitrogen (Каліфорнія, США). Зворотну транскриптазу M-MLV, інгібітор RNase та суміш dNTP отримували від Promega (штат Медісон, США), а SYBR Green PCR Master Mix - від компанії Roche (Базель, Швейцарія). Набір для аналізу тригліцеридів та набір для аналізу фарбування олійним червоним придбані в Інституті біотехнологій Цзянь Чень (Нанкін, Китай).
Виділення гепатоцитів
Первинна культура курячих гепатоцитів
Первинні курячі гепатоцити висівали в моношари в 6-лункові або 96-лункові пластикові пластини для культури (Корнінг, США) з щільністю 2 × 10 6 клітин на лунку у 2 мл або 1 × 10 5 клітин на лунку у 100 мкл сироватки- вільний середній M199. Додавали добавки: включаючи 5 мг/мл трансферину, 2 мМ глутаміну та 1,75 мМ HEPES. Поживне середовище також містило 100 МО/мл пеніциліну та 100 мкг/мл стрептоміцину. Гепатоцити інкубували при 37 ° C в атмосфері 95% повітря і 5% CO2. Після акліматизації через 24 години до середовища для культивування клітини культивували протягом 24 годин у середовищі M199 без фенолу червоного та FBS.
Аналіз життєздатності клітин
Клітини висівали на 96-лункові планшети по 1 × 10 5 клітин на лунку і обробляли 0, 1, 10 або 50 мкМ (-) - HCA протягом 1, 3, 6, 12 або 24 год перед додаванням розчину МТТ. Двадцять мікролітрів 5 мг/мл МТТ додавали в кожну лунку. Через чотири години культуральне середовище видалили і утворені кристали блакитного формазану розчинили в 150 мкл ДМСО. Оптичну щільність формазану, що генерується від МТТ, вимірювали при 490 нм за допомогою моделі 550 зчитувача мікропланшетів (Bio-Rad, Каліфорнія, США).
Оцінка рівня смертності клітин за допомогою тесту на лактатдегідрогеназу (ЛДГ)
Клітини вирощували в 96-лункових планшетах (1 × 10 5 клітин на лунку) і обробляли 0, 1, 10 або 50 мкМ при 1 × 10 5 клітин на лунку 100 мкл культурального середовища для 1, 3, 6, 12 або 24 год. Рівень смертності клітин оцінювали за кількісною оцінкою вивільнення лактатдегідрогенази (ЛДГ). Вміст LDH визначали за допомогою набору для аналізу цитотоксичності LDH (каталог №: C0016, Beyotine Biotechnology, Китай), а відсоток смертності клітин розраховували наступним чином: [(експериментальне вивільнення - спонтанне вивільнення)/(максимальне вивільнення - спонтанне вивільнення)] × 100. Спонтанне вивільнення та максимальне вивільнення були отримані шляхом інкубації клітин окремо або 0,1% розчином Triton x-100 відповідно.