Нейропротекторний та антиоксидантний вплив гемодіалізату Актовегін на первинні нейрони щурів у
Мартін В. Елмлінгер
1 Nycomed International Management GmbH, Thurgauerstrasse 130, 8152 Glattpark-Opfikon, Цюрих, Швейцарія
Мартін Крібель
2 Інститут природничих та медичних наук, 72770 Ройтлінген, Німеччина
Ден Циглер
3 Інститут клінічної діабетології, Німецький центр діабету, Центр дослідження діабету Лейбніца при Університеті Генріха Гейне, Дюссельдорф, Німеччина
4 Кафедра метаболічних хвороб, Університетська лікарня, Дюссельдорф, Німеччина
Анотація
Вступ
Діабетична дистальна симетрична полінейропатія (ДПН) вражає приблизно третину хворих на цукровий діабет і пов’язана зі значною захворюваністю, включаючи нестерпний невропатичний біль та виразки стопи, що призводять до ампутації (Ziegler et al. 2008; Boulton et al. 2005). Анальгетики ефективні при лікуванні невропатичного болю (Dworkin et al. 2007), але не уповільнюють прогресування основної нейропатії (Boulton et al. 2005). Були розроблені різні терапевтичні підходи до лікування ДПН (Cameron et al. 2001), які стосуються патології розладу, а не просто полегшують біль (Ziegler et al. 1995; Boulton et al. 2005; Chalk et al. 2007). Однак, незважаючи на очевидний недавній прогрес, потужна стійка терапія ДПН все ще залишається невирішеною медичною потребою.
Показано, що Актовегін, депротеїнізований гемодіалізат, вироблений з телячої крові, що містить низькомолекулярні сполуки до 5000 Да, має суттєві терапевтичні переваги при ДПН. Нещодавно було проведено рандомізоване подвійне сліпе плацебо-контрольоване клінічне дослідження з послідовним внутрішньовенним та пероральним лікуванням актовегіном 567 пацієнтів з ДПН протягом 160 днів (Ziegler et al. 2009). Лікування препаратом Актовегін суттєво покращило такі нейропатичні симптоми, як поріг сприйняття вібрації, сенсорні функції та якість життя пацієнтів з ДПН. Гемодіаліз схвалений у якості лікарського засобу (Актовегін ®) у ряді країн і застосовується для лікування діабетичної полінейропатії та інших захворювань (огляд див .: Buchmayer et al. 2011).
Метою цих досліджень було з'ясувати клітинні ефекти, за допомогою яких актовегін може здійснювати свої сприятливі терапевтичні ефекти в ДПН. Добре відомими фармакологічними діями актовегіну є стимуляція поглинання кисню, використання кисню та клітинний енергетичний обмін (Obermaier-Kusser et al. 1989; Buchmayer et al. 2011). Крім того, він проявляє інсуліноподібну активність, таку як стимуляція транспорту глюкози, піруватдегідрогенази та окислення глюкози (Jacob et al. 1996). Через ці властивості актовегін раніше використовувався для лікування судин головного мозку та дегенеративних розладів (Kanowski et al. 1995; Herrmann et al. 1992). Крім того, гемодіалізати, введені у вигляді інфузій, показали сприятливий вплив на клінічні ознаки деменції (Schlaffer et al. 1991; Beiswenger et al. 2008), що може свідчити про регенеративний ефект на нейрональну тканину.
Матеріали і методи
Підготовка нейрональних культур
Дисоційовані культури нейронів гіпокампа щурів готували за стандартним протоколом (Maar et al. 1997). Тканину гіпокампа з ембріональних плодів щурів 18-го дня збирали у стерильний розчин солі Хенкса (буфер HBSS [Invitrogen, Карлсруе, Німеччина], що містить 7 мМ HEPES, рН 7,3) і трипсинували за допомогою 1 × трипсину – ЕДТА (PAA, Пашинг, Австрія) містить 10 мМ HEPES, рН 7,3. Безсироваткове середовище та умови культивування були пристосовані для росту нейрональних клітин, щоб мінімізувати ріст забруднення інших, наприклад, типів гліальних клітин. Поєднання ядерного фарбування та фазово-контрастної мікроскопії забезпечило, що кількість підрахованих клітин відображає зміни кількості нейрональних клітин. Згодом тканину розтирали в буфері HBSS – HEPES, поки не було видно згустків тканин. Кількість клітин визначали і висівали 2 × 104 клітини/лунку в 100 мкл середовища NMEM-B27 (Burkarth et al. 2007; Goetze et al. 2003) у 96-лункові планшети, покриті полілілізином (Greiner Bio- One, Фрікенхаузен, Німеччина) і культивували при 37 ° C і 5% CO2.
Лікування актовегіном нейронів гіпокампа щурів
Нейрони гіпокампа щурів обробляли зростаючими дозами (0,3, 1, 3, 10, 30, 100, 300, 1000 мкг/мл) актовегіну (Actovegin ®, Nycomed, Лінц, Австрія) додаванням 50 мкл попередньо розведеного маточного розчину до культур, через 5 год після посіву. Випробовували широкий діапазон доз, оскільки було неможливо визначити дозу, яка відповідає дозі, застосовуваній у терапії хворих на цукровий діабет. Клітини культивували при температурі 37 ° C і 5% CO2 у зволоженій атмосфері. Ефекти лікування актовегіном досліджували щодо підтримки культури та синаптичної зв’язку, виростання невритів та нейропротекції (тобто захисту від індукованого Aβ25–35 апоптозу). Крім того, захист актовегіном від окисного стресу (рівні АФК) тестували на нейронах щурів.
Імуноцитохімія
Для імуноцитохімічного маркування дендритів антитілами проти асоційованого з мікротрубочками білка 2 (MAP2; на 3 і 6 дні культури in vitro) для подальшого аналізу невритового наросту та збудливих синапсів (везикулярний глутаматний транспортер 1 (VGlut1); день 10 ) з метою оцінки синаптичної зв’язку культивовані нейрони гіпокампа фіксували 4% параформальдегідом у забуференному фосфатом сольовому розчині (PBS) протягом 15 хв при кімнатній температурі.
Клітини промивали один раз PBS, а потім блокували і замочували блокуючим реагентом (Roche Diagnostics GmbH, Мангейм, Німеччина), що містить 0,2% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany), протягом 1 години при кімнатній температурі. Первинні антитіла проти білка 2, асоційованого з мікротрубочками (MAP2; Sigma-Aldrich) і везикулярного транспортера глутамату 1 (VGlut1; Synaptic Systems, Геттінген, Німеччина) розбавляли [1: 1000] в блокуючому реагенті, що містить 0,2% Triton X-100, і інкубували з клітини при 4 ° С протягом ночі. Клітини промивали PBS, і первинні антитіла виявляли за допомогою кон’югованого з Cy3 козячого анти-мишачого IgG (розведеного 1: 600; Діанова, Гамбург, Німеччина) під час 2-годинної інкубації при кімнатній температурі. Ядра фарбували Hoechst 33258 (1 мг/мл; Invitrogen GmbH, Дармштадт, Німеччина). Робоча концентрація 1 мкг/мл була досягнута шляхом розведення 1: 1000 у PBS. Клітини промивали і зберігали при 4 ° C до дослідження за допомогою флуоресцентної мікроскопії. Зображення було здійснено на Zeiss Axiovert 200.