Обмеження калорій збільшує біогенез мітохондрій м’язів у здорових людей

* Кому слід адресувати листування. Електронна адреса: [email protected]

Філія Пеннінгтонського центру біомедичних досліджень, Батон-Руж, Луїзіана, Сполучені Штати Америки

Ентоні Е Чівітарезе,
Стейсі Карлінг,
Леоні Кейлбронн,
Метью Х Гулвер,
Барбара Укропцова,
Вальтер Дойч,
Стівен Р. Сміт,
Ерік Равуссен

Цифри

Анотація

Передумови

Обмеження калорійності без недоїдання подовжує тривалість життя у багатьох організмів, включаючи комах та ссавців, і знижує вироблення вільних радикалів мітохондріями. Однак механізм, відповідальний за цю адаптацію, недостатньо вивчений.

Методи та висновки

Біохімічний аналіз

Тіло в організмі вимірювали за допомогою подвійної енергетичної рентгенівської абсорбціометрії (QDA 4500A, Hologics, http://www.hologic.com). Рівні інсуліну та три-йодтироніну (Т3) у сироватці крові вимірювали за допомогою імуноаналізів (DPC 2000, Diagnostic Products Corporation, http://www.dpc.com). Глюкозу в плазмі крові аналізували з використанням глюкозооксидазного електрода (Synchron CX7, Beckman, http://www.beckmancoulter.com), тоді як адипонектин визначали за допомогою нерадіоактивного ІФА (Linco, http://www.lincoresearch.com).

Кількісна оцінка мРНК експресії генів

Зразки біопсії Vastus lateralis (

150 мг) приймали після місцевої анестезії за методикою Бергстрома [19]. Жир та сполучну тканину видалили із зразка біопсії, а м’язи заморозили у рідкому азоті та зберігали при -80 ° C до завершення дослідження. РНК виділяли приблизно з 30 мг тканини за допомогою кислотно-фенольного методу та очищали колонками RNeasy (Qiagen, http://www.qiagen.com). ДНК екстрагували з тих самих зразків тканини після деградації білка та РНК за допомогою тризолу шляхом екстракції фенол-хлороформом та осадження етанолу згідно з процедурою виробника (Invitrogen, http://www.invitrogen.com). Праймери та зонди (таблиця S1) були розроблені з використанням Beacon Designer V2.1 (Bio-Rad, http://www.bio-rad.com). Реакції qRT (кількісний реальний час) -PCR проводили, як описано раніше [20]. Всі дані про експресію нормалізували шляхом ділення гена-мішені на RPLPO або мРНК пептидилпролілізомеразу B (PPIB) (яка кодує циклофілін B).

ПЛР у режимі реального часу для мітохондріальної ДНК

Відносні кількості ядерної ДНК та мітохондріальної ДНК (mtDNA) визначали методом qRT-PCR, як описано раніше [21]. Співвідношення мтДНК до ядерної ДНК відображає концентрацію в тканинах мітохондрій на клітину.

Мітохондріальна ферментативна діяльність скелетних м’язів

Антиоксидантна ферментна активність

Клітинні лізати готували обробкою ультразвуком у холодному 20 мМ буфері HEPES (рН 7,2), що містить 1 мМ ЕДТА, 210 мМ манітолу та 70 мМ сахарози, і центрифугували при 1500 g протягом 5 хв при 4 ° C. Загальну активність супероксиддисмутази (СОД) (Cu/Zn-, Mn- та Fe-SOD) визначали кількісно, вимірюючи дисмутацію супероксидних радикалів, що генеруються ксантиноксидазою. Активність ферменту визначали непрямим аналізом згідно з наявним у продажу набором аналізів Cayman Chemicals (http://www.caymanchem.com).

Потенціал мембрани мітохондрій та маса мітохондрій

Вимірювання потенціалу мітохондріальної мембрани етилового ефіру тетраметилродаміну (TMRE; Molecular Probes, http://probes.invitrogen.com) проводили, як описано раніше [22]. Для кількісного визначення мітохондріальної маси ми використовували зонд Mitotracker Green (Molecular Probes). Зонд Mitotracker Green переважно накопичується в мітохондріях незалежно від потенціалу мембрани мітохондрій і забезпечує точну оцінку маси мітохондрій. Клітини промивали PBS і інкубували при 37 ° C протягом 30 хв зі 100 нМ MitoTracker Green FM (молекулярні зонди). Клітини збирали з використанням трипсину/ЕДТА і ресуспендували в PBS. Інтенсивність флуоресценції виявляли при довжинах хвиль збудження та випромінювання 490 і 516 нм, відповідно, і значення коригували для загального білка (мг/мл).

Культура клітин скелетних м’язів

Біопсія м’язів Vastus lateralis (

100 мг) були отримані від п'яти здорових, нормальної ваги, молодих, сидячих особин (індекс маси тіла = 24,1 ± 0,5 кг/м 2; жир в організмі = 15% ± 1%; концентрація глюкози натще = 88 ± 2 мг/дл; інсулін у плазмі натще = 4,4 ± 0,9 мкУ/мл). Клітини-супутники були виділені, як описано раніше [23]. Клітини висівали в 12-лункові (РНК/ДНК) та шестилункові планшети (білок) при щільності 20 × 10 3 клітин/см 2. Клітини вирощували при 37 ° С у зволоженій атмосфері 5% СО2. Дві пари заважаючих (si) РНК стелс хімічно синтезували (Invitrogen), віджигали та трансфікували (200 пмоль/мл) у 50% -70% зливні первинні міоцити людини за допомогою реагентів для трансфекції siRNA GeneSilencer (Генна терапія, http: //www.genetherapysystems.com). Послідовності чутливих siРНК наступні; AdipoR1, 5′-AAACAGCACGAAACCAAGCAGAUGG-3 ′; AdipoR2, 5′-AUGUCCCACUGGGAGACUAUAAUGG-3 ′. Клітини, трансфіковані нефункціонально перемішаною siRNA (макет) (Ambion, http://www.ambion.com), використовувались як негативні контролі (неопубліковані дані). Диференціацію міобластів у міотрубки розпочали, як описано раніше [23]. Через 72 год після індукції диференціювання середовище змінювали та обробляли глобулярним адипонектином ссавців протягом 48 год (R&D Systems, Міннеаполіс, Міннесота, США) або донором оксиду азоту - 50 мкМ 2,2 ′ - (гідроксинітрозогідразоно) біс-етамінімін (DETA-NO) (Sigma, http://www.sigmaaldrich.com) - один раз на день протягом 4 днів [7,24].

Статистичні методи

Дані виражаються як середнє значення ± стандартні похибки середнього значення. Аналіз даних проводився за допомогою SAS v. 9.1 (http://www.sas.com). Зміни від вихідного рівня до 6-го місяця аналізували шляхом аналізу коваріантності з лікуванням та взаємодією у часі та базовим значенням, включеним до складу коваріати. В експериментах на культурі клітин для визначення ефекту лікування використовували t-тести. Там, де це було доречно, використовували кореляції Пірсона або Спірмена. Дані вважалися значущими, якщо p Таблиця 1.