Порушення вимирання страху через дефіцит припливу Са2 через напружені канали Са2 L-типу
Фабіо Морелліні
1 Інститут біосинтезу нейронних структур, Zentrum für Molekulare Neurobiologie Hamburg, Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Німеччина
2 Дослідницька група поведінкової біології, Zentrum für Molekulare Neurobiologie Hamburg, Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Germany
Олексій Малишев
3 Кафедра нейрофізіології Рурського університету в Бохумі, Бохум, Німеччина
4 Інститут вищої нервової діяльності та нейрофізіології Російської академії наук, Москва, Росія
Максим Волгушев
3 Кафедра нейрофізіології Рурського університету в Бохумі, Бохум, Німеччина
4 Інститут вищої нервової діяльності та нейрофізіології Російської академії наук, Москва, Росія
5 Департамент психологічних наук, Університет штату Коннектикут, Сторрс, Коннектикут, США
Марина Чистякова
3 Кафедра нейрофізіології Рурського університету в Бохумі, Бохум, Німеччина
5 Департамент психологічних наук, Університет штату Коннектикут, Сторрс, Коннектикут, США
Джорджі Папашвілі
1 Інститут біосинтезу нейронних структур, Zentrum für Molekulare Neurobiologie Hamburg, Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Німеччина
Летиція Фелліні
1 Інститут біосинтезу нейронних структур, Zentrum für Molekulare Neurobiologie Hamburg, Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Німеччина
Ральф Кліні
1 Інститут біосинтезу нейронних структур, Zentrum für Molekulare Neurobiologie Hamburg, Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Німеччина
Мелітта Шахнер
6 Центр неврології, Медичний коледж університету Шаньтоу, Шаньтоу, Китай
7 Центр спільної нейронауки і відділ клітинної біології та нейронауки Кека, Університет Рутгерса, Піскатей, штат Нью-Джерсі, США
Олександр Дитятьов
1 Інститут біосинтезу нейронних структур, Zentrum für Molekulare Neurobiologie Hamburg, Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Німеччина
8 Група молекулярної нейропластичності, Німецький центр нейродегенеративних захворювань (DZNE), Магдебург, Німеччина
9 Медичний факультет, Університет Отто-фон-Геріке, Магдебург, Німеччина
10 Центр поведінкових наук про мозок (CBBS), Магдебург, Німеччина
Анотація
Вступ
Тенасцин-С (ТНК) помітно експресується в різних тканинах під час розвитку. У центральній нервовій системі, що розвивається, ТНК бере участь у регулюванні проліферації клітин-попередників олігодендроцитів та астроцитів. Експресія TNC регулюється в мозку дорослого, за винятком областей, що підтримують нейрогенез у дорослому віці, таких як гіпокамп та гіпоталамус (Wiese et al., 2012). Після травми експресія TNC регулюється в нейронах, що відповідають на образу. TNC підтримує регенерацію спинного мозку, сприяючи відростанню аксонів та утворенню синапсів в каудальному відділі спинного мозку до місця ураження (Yu et al., 2011).
Селективне порушення LTP, викликане протоколами, які включають активацію L-VGCC у мишей TNC -/-, припускає, що дефіцит TNC призводить до порушення експресії та/або функціональності цих каналів, які складаються з 3-4 субодиниць: утворюючи α1 субодиницю та допоміжну β, а також субодиниці α2δ та γ (Hofmann et al., 1994). У мозку ссавців Cav1.2 і Cav1.3 є двома основними α1-субодиницями L-VGCC, які становлять важливий шлях проникнення Ca 2+ в нейрони.
Тут ми намагалися більш щільно пов’язати спостережуваний дефіцит LTP у мишей TNC -/- зі зниженою функцією кальцієвих каналів L-типу та дефіцитом поведінки. Ми показуємо, що у мишей TNC -/- рівень експресії двох субодиниць L-VGCC α1 не знижується, але приплив Са 2+ через L-VGCC значно зменшується. Далі ми показуємо залежність від L-VGCC при вимиранні контекстуальних спогадів страху у мишей TNC -/-. Ми прийшли до висновку, що порушення функціональності L-VGCC може бути причиною погіршення LTP та поведінкового дефіциту у мишей TNC -/-.
Матеріали і методи
Миші TNC -/- (Evers et al., 2002) були виведені на тлі C57BL/6. Тет-дванадцяти тижневі самці ТНК -/- і ТНК +/+ одноплідники були отримані при гетерозиготному розведенні та утримувались при перевернутому світлі 12:12 год: темному циклі (світло вимикається о 07:00) та стандартних умовах утримання (23 ± 1 ° C; 50% вологості; їжа та вода ad libitum). Тести на поведінку проводили в експериментальній кімнаті, що прилягала до приміщення для тварин, і освітлювали неяскравим червоним світлом. Експерименти проводились в середині темної фази циклу. Всі матеріали очищали мильною водою, водою та етанолом (75%) між мишами. Експерименти проводились відповідно до Директиви Ради Європейського Співтовариства (86/609/ЄЕС), а використовувані процедури були затверджені штатом Гамбург. Було зроблено обережність, щоб мінімізувати біль або дискомфорт для тварин.
Аналіз вираження Cav1.2 та Cav1.3
Поліклональні антитіла проти субодиниць Cav1.2 і Cav1.3 L-VGCC були люб'язно надані Р. Вестенбруком та В. Каттераллом і описані в інших місцях (Hell et al., 1996). Моноклональні антитіла проти гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогенази кролика (GAPDH) отримано від Chemicon International (Темекула, Каліфорнія, США).
Імуногістохімічний аналіз експресії Cav1.2 та Cav1.3 проводили, як описано Kochlamazashvili et al. (2010). Для вестерн-блоттінгу гіпокампі гомогенізували в 200 мкл ТЕ-буфера (50 мМ Трис/HCl, 5 мМ ЕДТА, рН 8). Після визначення концентрації білка за допомогою аналізу білка BCA TM (Thermo Scientific, Рокфорд, Іллінойс, США) 50 мкг білків на смугу піддавали SDS-PAGE на 10% гелях з подальшим аналізом Вестерн-блот. Білки переносили на нітроцелюлозну мембрану (Protran, Schleicher and Schuell, Dassel, Німеччина), і мембрану блокували 5% нежирним сухим сухим молоком у PBS, рН 7,5. Мембрану інкубували з первинним антитілом (1: 1000) протягом ночі при 4 ° C з струшуванням, промивали в PBS 0,05% Твін (PBS-T) і зондували кон'югованим з HRP вторинним антитілом (1: 10000 в PBS, що містить 5% сухого молока) протягом 1 год. Після промивання імунодетекцію проводили з використанням хемілюмінесцентного субстрату з тривалою тривалістю (Пірс, Бонн, Німеччина) на рентгенівських плівках (Kodak Biomax-ML, Sigma-Aldrich). Інтенсивності смуг були денситометрично визначені за допомогою програмного забезпечення для зображення TINA 2.09 (DesignSoft Inc., Будапешт, Угорщина).
Записи LTP у зрізах гіпокампа
Ca 2+ Візуалізація
Контекстуальне кондиціонування страху
Препарати для поведінкових експериментів
Ніфедипін (25 мг/кг) суспендували у 10% -ному носії Cremophor EL/PBS, а дилтіазем (15 мг/кг) - у фізіологічному розчині (0,9% NaCl у воді). Внутрішньочеревні ін'єкції виконували за 50 хв (ніфедипін) або 20 хв (дилтіазем) до випробування з відкликанням та протоколу вимирання, проведеного на 2-й день контекстного тесту кондиціонування страху.
Статистичний аналіз
Порівняння двох груп проводили за допомогою двостороннього t-тесту. Дані про поведінку оцінювали за допомогою багатофакторного дисперсійного аналізу (ANOVA), за яким, за необхідністю, проводили пост-хост-тести Ньюмана-Кельса: двосторонній ANOVA (з «генотипом» та «лікуванням» як між факторами груп), змішаний двосторонній (з « генотип »як між факторами груп та« часом »як усередині фактора групи) та змішаним тристороннім ANOVA (з« генотипом »та« лікуванням »як між факторами груп, так і« часом »як фактором групи). Всі тести були двосторонніми, і рівень значимості був встановлений на рівні p -/- Мишей врятовують тимчасовою активацією L-VGCC під час індукції LTP