Повна стаття Депо-специфічні адипоцити-позаклітинний матрикс метаболічних перехресних зв’язків при ожирінні мишей

Короткий звіт

Повна стаття
Цифри та дані
Список літератури
Цитати
Метрики
Ліцензування
Передруки та дозволи
PDF

АНОТАЦІЯ

Підшкірна (SAT) та вісцеральна (VAT) жирова тканина мають чіткі метаболічні фенотипи. Ми припустили, що позаклітинний матрикс (ECM) регулює депо-специфічні відмінності в метаболічній функції адипоцитів при ожирінні мишей. Преадипоцити VAT та SAT від нежирних або ожирілих мишей піддавались адипогенній диференціації в стандартній 2D-культурі на пластикових пластинах для культури тканин або в 3D-культурі в ECM з подальшим метаболічним профілюванням. Адипоцити від ПДВ відносно САТ виявляли порушення стимульованого інсуліном поглинання глюкози та зниження адипогенної здатності. У культурі 3D-ECM-адипоцитів ECM регулював метаболізм адипоцитів специфічно для депо, за допомогою SAT ECM, рятуючи дефекти всмоктування глюкози та експресію адипогенного гена в адипоцитах VAT, тоді як VAT ECM порушував експресію адипогенного гена в адипоцитах SAT. Ці висновки демонструють, що перехресні зв’язки ECM-адипоцити регулюють депо-специфічні відмінності в метаболічній дисфункції адипоцитів при ожирінні мишей.

Вступ

Матеріали і методи

Експерименти були схвалені Інституційним комітетом з догляду та використання тварин Університету Мічигану відповідно до положень AAALAC. Восьмитижневих самців мишей C57Bl/6 годували протягом 8 тижнів за нормальним раціоном (ND) або дієтою з високим вмістом жиру (HFD) (60% жирних калорій, Research Diets Inc., Cat # D12492). Кількість мишей, використаних для кожного експерименту, описана на малюнках. Ваги тіла вимірювали щотижня. В кінці протоколу годування було проведено тест на толерантність до глюкози (GTT), як описано [13], після чого відбулася евтаназія та збір ПДВ (епідидимальна жирова прокладка) та SAT (пахова/пахова жирова прокладка).

Культура клітин

В пробірці метаболічні аналізи

Площа адипоцитів

Площа адипоцитів ПДВ і SAT (мкм 2) вимірювали за допомогою фіксованих зрізів, зафарбованих гематоксиліном/еозином, зображених на флуоресцентному мікроскопі Olympus IX-81 із використанням каналу Texas Red (595–605 нМ). Зображення було зафіксовано у вигляді множинних зображень із масштабом сірого TIFF та проаналізовано за допомогою програмного забезпечення ImageJ. Площу адипоцитів вимірювали в 200–500 клітинах з кількох предметних стекол на зразок і усереднювали для кожної проби тканини.

Накопичення ліпідів

Скануюча електронна мікроскопія [12] та фарбування маслом Red-O (Sigma Aldrich Inc., Cat # O0625) використовувались для зображення 3D-ECM/адипоцитів для оцінки накопичення ліпідів після диференціації. AdipoRed (Lonza Inc., Cat # PT-7009) був використаний для кількісної оцінки накопичення адипоцитів у ліпідних культурах у 2D-пластиці та стандартизований за загальним білком, виміряний за допомогою аналізу Pierce BCA (ThermoFisher Scientific Inc., Cat # 23225).

Кількісна ПЛР (qPCR)

РНК із SAT та ПДВ отримували у Trizol та адипоцитах із 2D та 3D культур із використанням RNeasy Mini Kit та RNeasy Fibrous Tissue MiniKit (Qiagen Inc., Cat # 74104, 74704), відповідно. Чистоту, концентрацію та цілісність мРНК оцінювали за допомогою спектрофотометра NanoDrop 1000 (ThermoFisher Scientific Inc., Cat # ND-ONE-W). Варто зазначити, що екстракція РНК із „порожньої ECM”, не засіяної клітинами, не дала виявляти або ампліфікувати РНК, що підтверджує повне видалення РНК із препаратів ECM перед засіванням клітинами. Рівні кількості РНК із цілого SAT та ПДВ або адипоцитів із 2D та 3D систем культивування були зворотно транскрибовані з використанням архівного набору кДНК високої ємності (Applied Biosystems Inc., Cat # 4368814). кДНК вивчали за допомогою qPCR, використовуючи аналізи експресії та реагенти генів Taqman (Life Technologies Inc.), використовуючи термоциклер StepOnePlus (Applied Biosystems Inc., Cat # 4376600). Дані представлені у вигляді кратних змін, розрахованих із середніх відмінностей найменших квадратів згідно з методом 2 -ΔΔCT [15] та нормалізованих до середнього показника гена ведення господарства β2-мікроглобуліну (B2 M), для якого значення КТ не змінювались між жировими депо з Мишей HFD, а також між різними збігами ECM-адипоцитів (P> 0,05). Значення КТ 40 було присвоєно підірваним значенням КТ для розрахунків зміни складок.

Аналіз поглинання глюкози (GUA)

Відповіді на інсулін оцінювали за допомогою GUA, як описано [12]. Коротко кажучи, адипоцити в культурах 2D-пластики або 3D-ECM голодували сироваткою протягом ночі, а потім інкубували з PBS/2% BSA при 37 ° C протягом 2 годин з подальшою стимуляцією інсуліном (200 нМ) 37 ° C протягом 40 хв. Поглинання глюкози оцінювали шляхом поглинання 2-дезокси глюкози (0,1 мМ; Sigma-Aldrich Inc., Cat # D6134) та дезокси-d-глюкози-2- [1,2–3 H (N)] (2 мкКі/мл; PerkinElmer Inc., Cat # NET549001MC) протягом 40 хв і вимірюється за допомогою сцинтиляційного підрахунку (відліків в хвилину, cpm), нормалізованого до клітинного білка (DC ™ протеїновий аналіз, Bio-Rad, Inc., Cat # 5000112).

Статистичний аналіз

Результати

Ожиріння викликає системну резистентність до інсуліну та змінює профіль експресії гена ECM жирової тканини

8-тижневий HFD спричинив збільшення маси тіла на 5,30 ± 1,35 г (середнє значення ± SEM; P = 0,001, малюнок 1 (a)), збільшення ваги ПДВ та депозиту SAT, зменшення маси печінки (малюнок 1 (a, b)), та системну інсулінорезистентність, виміряну GTT (рис. 1 (в)). Порівняно з ND, HFD індукує гіпертрофію адипоцитів, яка була більшою за ПДВ, ніж SAT (рисунок 1 (e)), та депо-специфічні зміни експресії жирової тканини множинних ECM та адипогенних генів (рис. 1 (f)): COL1A1, COL4A1 та LOX були регульовані в СБ, в той час як COL3A1, LAMB1 і FN1 були надрегульовані як в ПДВ, так і в ПДВ; MMP2, MMP9, і VTN були регульовані в рамках ПДВ та ПДВ; CTGF вираз був збільшений в суботній системі, але зменшений у ПДВ. Адипогенні гени CEBPA, PPARG, FASN, ATGL, ADIPOQ, і КЛЮЧ4 були зменшені з ПДВ, але не ПДВ у відповідь на HFD LEP експресія була збільшена в обох складах у відповідь на HFD. Ці дані демонструють, що ожиріння погіршує системну чутливість до інсуліну, індукує гіпертрофію тканини адипоцитів та індукує закономірність експресії генів, що відповідає збільшенню відкладення ECM в обох депо, а також знижує адипогенез у ПДВ, але не в САТ.