Позаклітинний профіль РНК у мезентеріальній лімфі з модельних гострих та критичних моделей щурів

Адреса кореспонденції: Дживон Хонг, доктор філософії, лабораторія прикладної хірургії та метаболізму, Школа біологічних наук, Оклендський університет, 3A Symonds Street, Private Bag 92019, Окленд 1142, Нова Зеландія

Школа біологічних наук, факультет наук, Університет Окленда, Окленд, Нова Зеландія.

Центр хірургічних та поступальних досліджень, Факультет медицини та наук про здоров'я, Оклендський університет, Окленд, Нова Зеландія.

Школа біологічних наук, факультет наук, Університет Окленда, Окленд, Нова Зеландія.

Кафедра молекулярної медицини та патології, Факультет медицини та медичних наук, Оклендський університет, Окленд, Нова Зеландія.

Школа біологічних наук, факультет наук, Університет Окленда, Окленд, Нова Зеландія.

Анотація

Передумови: Мезентеріальна лімфа (ML) була залучена до розвитку синдрому поліфункції поліорганних органів при критичній хворобі. Позаклітинні РНК відіграють роль у взаємодії клітин з клітинами під час фізіологічних процесів та процесів захворювання, але їх рідко вивчають у ML. Ми мали на меті вивчити профілі РНК периферичної плазми, ML та позаклітинних пухирців ML (ML-EV) та багатих тригліцеридами ліпопротеїнів (ML-TRL), отриманих на моделях гризунів критичного захворювання.

Методи та результати: Ми збирали ML протягом 5 годин на моделях гризунів для критичних захворювань [Гострий панкреатит, перев’язка та різання цекули (CLI), Ішемія-реперфузія кишечника (IR)] та відповідні щури контрольної групи Sham. Також були виділені фракції ML-EV та ML-TRL. Секвенування РНК проводили на РНК, вилученій з ML, ML-EV, ML-TRL та плазми, за допомогою платформи Ion Torrent Personal Genome Machine. Послідовності РНК шукали за допомогою Базового інструменту пошуку локальних вирівнювань проти генома щурів та RefSeq, мікроРНК (miRNA), геномної тРНК, функціональної РНК та нуклеотидних баз даних Genbank, і аналізували кількість зчитувань. Кожен тип зразка мав чіткий профіль РНК. ML містив більше РНК на об'єм і більшу частку фрагментів тРНК, ніж плазма. ML-EV були збагачені мікроРНК, тоді як ML-TRL містили низькі абсолютні кількості РНК. Профілі розмірів РНК для CLI та Gut IR відрізнялися від Sham. ML несла кишкові РНК, і в моделі CLI вона була значно збагачена бактеріальними послідовностями РНК.

Висновки: Ми виявили різні, але різноманітні профілі РНК ML та його відділів, а також їх різні профілі при критичній хворобі. Кишкові малі РНК у ML можуть відігравати безпосередню роль у важких захворюваннях та корисності як потенційні біомаркери.

Вступ

Різні регуляторні види РНК 1 стабільні поза клітиною 2 і відіграють роль у клітинному спілкуванні 3 та інших біологічних або патологічних процесах. 2,3 Такі позаклітинні РНК, 1 з яких найбільш вивченою є мікроРНК (miРНК), 2,3 були знайдені в різних біорідинах, 4,5 де вони можуть бути упаковані з позаклітинними везикулами (EV), 6 ліпопротеїнами, 7 і інші рибонуклеопротеїнові комплекси. 3

Лімфатична система - це організована мережа лімфоїдної тканини; він транспортує тканинну рідину/лімфу та лімфоїдні клітини 8, а різні патологічні стани, такі як запалення, рак та інфекція, можуть спричинити зміни лімфатичної функції. 9 Брижова лімфа (ML) безперервно стікає з кишечника і знову надходить у кровообіг у підключичній вені безпосередньо перед серцем та легенями. ML проходить прямий анатомічний шлях між кишечником і периферичним кровотоком, не проходячи через печінку. Для здоров’я ML дуже важливий для рідинного гомеостазу та поглинання ліпідів у їжі. Багаті тригліцеридами ліпопротеїни (TRL) є основними ліпопротеїнами в ML, які транспортують ліпіди кишечника до крові. При захворюванні ML стає важливим фактором10, і він причетний до розвитку синдрому поліфункції органів при критичній хворобі. 10 Хоча мікроРНК були виявлені в рамках панкреатиту ML моделі гризунів та пацієнтів, що використовують підходи мікрочипів, ще 11 позаклітинних РНК або інших типів критичних захворювань ще не вивчено.

Тут ми вперше дослідили малі профілі РНК плазми та ML, зібрані з різних моделей гризунів критичного захворювання [Гострий панкреатит, перев’язка та різання цекули (CLI), Ішемія-реперфузія кишечника (IR)] за допомогою секвенування іонних потоків.

Матеріали і методи

Повні відомості див. У Додаткових даних. Коротко кажучи, гострий панкреатит, CLI та ІР кишечника були індуковані у дорослих самців щурів Sprague-Dawley. Підроблені щури контролю піддавались такому ж втручанню, але без індукції захворювання. Для дренажних моделей вищий протокол ML був канюльований для безперервного збору ML на льоду протягом 5 годин від щурів. Зразки периферичної плазми відбирали у всіх досліджуваних щурів в один момент часу після завершення 5-годинного збору лімфи. Для ІФК CLI та кишечника, збагачені EV та TRL фракції виділяли з ML (ML-EV; ML-TRL) за допомогою екзосомного розчину Мачері-Нагеля та диференціального ультрацентрифугування відповідно. Мале РНК-секвенування проводили на РНК, витягнутій із об’єднаних зразків плазми ( = 3), ML ( = 3), ML-EV ( = 4) та ML-TRL ( = 5) на платформі Ion Torrent Personal Genome Machine. Послідовності РНК відфільтровували та шукали за допомогою Базового інструменту пошуку місцевих вирівнювань (BLAST) щодо різних баз даних, включаючи геном щурів та RefSeq, мікроРНК, геномну тРНК, функціональну РНК та базу даних нуклеотидів Genbank. Послідовності РНК класифікували, а кількість зчитування аналізували.

Результати і обговорення

Існували чіткі відмінності в профілях РНК між ML та плазмою. Нещодавно відмінності у складі малих РНК між 12 біорідинами людини характеризували Godoy et al., 5 але ML не досліджували. ML містив більше РНК на об'єм, ніж плазма, загальний вхідний показник і показники зчитування, що відповідають BLAST, були> у 20 разів вищими (рис. 1А; Додаткова таблиця S1). Хоча> 90% корисних показників як у ML, так і в плазмі були визначені як такі, що мають "щуряче" походження, їх підтипи РНК зустрічались у різних пропорціях (рис. 1B). Найбільш помітною різницею була пропорція тРНК:> 90% спостерігалося в ML відносно ~ 45% у плазмі щурів Sham, причому більшість складали половини тРНК (~ 32 nt; половина тРНК повної довжини). Серед різних половин тРНК найпоширеніша половина тРНК, виявлена в цьому дослідженні, була отримана з 5 ′ кінця Gly-GCC (тРНК з антикодоном GCC розпізнає кодон GCC, який кодує гліцин): середнє значення 48% від загальної кількості щурів тРНК у ML та 69% у плазмі щурів Sham (рис. 1С). Надмірне представлення фрагментів тРНК може бути артефактом звичайних методів секвенування РНК, 12–14, але інші дослідження 15, 16 показали, що різні стресові умови можуть спричинити розщеплення тРНК, і ці фрагменти тРНК служать невеликими інтерферуючими РНК, які регулюють активність коефіцієнта перекладу.