Протеомний аналіз скелетних м’язів на цукровий діабет із ожирінням та хворим ожирінням

Анотація

  • АК, аденилаткіназа
  • AMPK, AMP-активована протеїнкіназа
  • CK, креатинкіназа
  • GAPDH, гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогеназа
  • HOMA, оцінка моделі гомеостазу
  • MALDI, матрична лазерна десорбція/іонізація
  • МС, мас-спектрометрія
  • pI, ізоелектрична точка
  • TOF, час польоту

Втрата системного гомеостазу глюкози та ліпідів, який включає безліч систем органів, спричиняє захворювання, пов’язані з ожирінням, такі як метаболічний синдром та діабет 2 типу. Зокрема, вважається, що дефекти виникають у ключових метаболічних процесах, які спрямовують надходження, зберігання та окислювальний катаболізм глюкози та жирних кислот (1–4). В даний час широко прийнято вважати, що скелетні м'язи відіграють значну роль у регулюванні рівня циркулюючої глюкози та ліпідів, і що ця здатність суттєво пригнічується у людей із ожирінням та/або неактивних осіб (2,3,5). Насправді, нещодавні дослідження скелетних м’язів людини виявили зменшення відсотка м’язових волокон типу I (окислювальні) та паралельне зменшення транспорту глюкози в м’язах та окислення ліпідів у людей із ожирінням, що страждають на діабет 2 типу та без нього, порівняно з худими контрольними суб’єктами (2, 3,5,6). Ці спостереження вказують на значну метаболічну дисфункцію м'язів у людей із ожирінням, що сприяє розвитку непереносимості глюкози, дисліпідемії та можливого початку діабету 2 типу.

протеомний

Нові методи неупередженого встановлення складних молекулярних подій у хворих, пошкоджених та пристосованих до фізичних навантажень скелетних м’язах включають використання олігонуклеотидних мікрочипів та протеомічний аналіз за допомогою мас-спектроскопії (7–10). Незважаючи на те, що було проведено ряд досліджень мікрочипів діабетичних та ожирених м'язів на різних експериментальних моделях тварин та людей, єдиним реальним консенсусом є очевидне зниження регуляції генів, що кодують ферменти окисного метаболізму з ожирінням та діабетом (11). Хоча рівні транскриптів мРНК гостро реагують на метаболічні та механічні порушення в м’язах, вони не завжди негайно перетворюються на зміни в кількості достатніх їм білкових продуктів (7,9). Отже, зростає підтримка використання методів білкового профілювання, які допомагають виробляти більш всебічну молекулярну етіологію ремоделювання м’язів та захворювань.

Стандартизація двовимірного електрофорезу та дедалі швидша ідентифікація білка за допомогою мас-спектроскопії зробила високопродуктивну оцінку змін експресії білка як практичною, так і економічною (9,12). У цьому дослідженні ми проаналізували цитозольні білки скелетних м’язів від худих жінок, що страждають ожирінням/надмірною вагою та хворіють ожирінням, щоб виявити ферменти, які можуть спричинити дефекти м’язового обміну. У цьому попередньому дослідженні розчинних цитозольних екстрактів було виявлено аденилаткіназу (АК) 1, гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогеназу (GAPDH) та альдолазу А як переважно виражені в екстрактах м’язів ожирілих та хворих із ожирінням осіб порівняно з худими суб’єктами контролю. Ми вважаємо, що це відкриття дає механістичне уявлення про дефекти м'язового обміну, які лежать в основі прогресування метаболічних захворювань, пов'язаних з ожирінням.

ДИЗАЙН ДИЗАЙН І МЕТОДИ

У цьому дослідженні брали участь вісімнадцять жінок, у складі яких було 6 нормальної ваги (вік 45,1 ± 3,1 року; ІМТ 23,8 ± 0,58 кг/м 2; і оцінка моделі гомеостазу [HOMA] 1,10 ± 0,26), 6 осіб із зайвою вагою/ожирінням (вік 44,0 ± 2,8 років; ІМТ 30,2 ± 0,81 кг/м 2; HOMA 1,6 ± 0,47) та 6 надзвичайно ожирілих (вік 37,9 ± 3,3 року; ІМТ 53,8 ± 3,5 кг/м 2; HOMA 3,6 ± 1,1) пацієнтів, які перенесли операцію на черевній порожнині, переважно шлунковий шунтування та повна абдомінальна гістеректомія (3). Учасники дослідження були класифіковані за відповідними групами на основі ІМТ та класифікацій надмірної ваги та ожиріння, встановлених Національним інститутом охорони здоров’я (13). Критеріями ІМТ для осіб із нормальною вагою, надмірною вагою/ожирінням та надзвичайним ожирінням були 24,9, 25,0–34,9 та ≥40 кг/м 2 відповідно. HOMA для інсулінорезистентності та функції β-клітин розраховували на основі концентрації глюкози та інсуліну натще (14). Експериментальний протокол був схвалений Комітетом з питань досліджень та досліджень людини в Університеті Східної Кароліни та відповідав принципам, висловленим у Гельсінській декларації. Інформована згода була отримана від усіх пацієнтів. Жоден із випробовуваних не мав жодних захворювань і не приймав ліків, які, як відомо, змінюють вуглеводний або ліпідний обмін.

Екстракція дигітоніну цитозольних білків.

Зразок тканини прямого черевного преса отримували під час операції та обробляли, як описано раніше (3). Цитозольні білки екстрагували з 25–30 мг подрібненої азотом тканини з використанням 500 мкл буфера екстракції дигітоніну (10 ммоль/л ТРУБ, 0,015% дигітоніну, 300 ммоль/л сахарози, 100 ммоль/л NaCl, 3 ммоль/л MgCl2, 5 ммоль/л ЕДТА та 1 ммоль/л інгібітора протеази [фенілметилсульфонілфторид], рН 6,8) з легким інвертуванням при 4 ° С протягом 20 хв (12). Цитозольну фракцію відокремлювали від решти клітинної гранули центрифугуванням при 500g протягом 10 хв. Клітинні гранули заморожували миттєво і зберігали при -80 ° C для подальшого аналізу. Супернатант, що містить цитозольний білок, переносили в чисту пробірку і центрифугували при 8000 г протягом 20 хв. Концентрацію білка визначали у кінцевій супернатанті, використовуючи реагент для аналізу білків Bio-Rad, дотримуючись вказівок виробника (Bio-Rad, Hercules, CA). Потім зразок зберігали в аликвотах по 500 мкл у мікроцентрифужних пробірках при -80 ° C.

Двовимірний гель-електрофорез.

Двовимірна кількісна оцінка та аналіз гелю.

Двовимірні гелі аналізували за допомогою програмного пакету Z3 (Compugen, Тель-Авів, Ізраїль) з використанням налаштувань, рекомендованих виробником. Ізоелектричну точку (pI) та молекулярну масу розраховували, виходячи з положення кожного білка в смужці IPG та гелі другого розміру. Диференціально експресовані білки, середні значення інтенсивності та стандартні відхилення були розраховані для кожної плями та нормалізовані до відповідних плям на пісних головних гелях.

Приготування та ідентифікація мас-спектрометрії білків.

Плями вирізали кінчиком чистої поліпропіленової піпетки і переносили в мікроцентрифужну пробірку, що містить 100 мкл деіонізованої води. Триптичне розщеплення проводили, як описано раніше (9), і пептиди екстрагували, а потім сушили вакуумним центрифугуванням. Потім висушені пептиди розчиняли у 10 мкл 0,1% трифтороцтової кислоти та знесолювали за допомогою наконечників мікропіпеток C18 ZipTip (Millipore, Бедфорд, Массачусетс), дотримуючись інструкцій виробника. Аликвоти пептидних розчинів були помічені на матриці з допомогою лазерної десорбції/іонізації (MALDI). Мас-спектрометрію (MS) та тандемну мас-спектрометрію (MS/MS) проводили на мас-спектрометрі 4700 ABI під час прольоту (TOF) -TOF (Applied Biosystems, Фостер-Сіті, Каліфорнія), оснащеному Nd: YAG 200 Гц лазер. Прилад працював із затримкою екстракції в режимі позитивних іонів рефлерона. Для зовнішньої калібрування приладу використовували суміш стандартних пептидів. Ідентифікація білка проводилася за допомогою програмного забезпечення GPS explorer (Applied Biosystems) та бази даних MASCOT. Для ідентифікації білка використовувались дані як MS, так і MS/MS.