PTP-3 (LAR PTPR) сприяє внутрішньомолекулярному згортанню SYD-2 (ліпрін-α) для інактивації UNC-104 (KIF1A) у

Знайдіть цього автора на Google Scholar
Знайдіть цього автора на PubMed
Шукайте цього автора на цьому сайті
Запис ORCID для Олівера Інгвара Вагнера
Для листування: [email protected]

Анотація

Вступ

Результати

Функціональна та генетична взаємодія між UNC-104, SYD-2 та PTP-3

(A-E) PTP-3B: CFP та GFP: Колокалізація SYD-2 у нервових кільцях (A-D) та черевних нервових канатиках (E). (D) Псевдокольорове зображення PDM (див. Матеріали та методи), що вказує на кількісно визначену колокалізацію між SYD-2 та PTP-3B у нервовому кільці. (F) Кількісна оцінка ICQ даних, наведених у (C). (G) Позитивний сигнал PTP-3B/SYD-2 BiFC в нервовому кільці живих хробаків, що вказує на те, що SYD-2 і PTP-3B знаходяться принаймні на 7-10 нм близько один до одного. (H) Черв'як, що експресує SNB-1: mRFP під загальнонейрональним промотором. (I) Об’єднане зображення з (G) та (H). (J) Стек випрямлених VNC (вентральних нервових канатиків) та нейронів ALM з позитивними сигналами PTP-3B/SYD-2 BiFC. * - вказує розташування соми в нейронах ALM. Стрижні шкали: 10 мкм. N = 10 черв'яків у (F). Панель помилок: ± макс. і хв. діапазон. A - передній напрямок і P - задній напрямок.

Відсутність тригерів PTP-3B збільшувало розгорнуті стани SYD-2

Оскільки SYD-2 існує у функціонально складених станах, ми припускаємо, що внутрішньомолекулярне згортання SYD-2 впливає на його схильність до зв'язування з UNC-104. Як згадувалося вище, ми припускаємо, що у мутантів ptp-3 зменшене дефосфорилювання SYD-2 при Y741 призведе до збільшення розгорнутого стану, що посилить його взаємодію з UNC-104. Для підходу до цього питання ми застосували внутрішньомолекулярні аналізи FRET [39], як показано на малюнку 3А. З малюнків 3B та C видно, що коефіцієнт FRET (IFRET/ID) злиття Cypet: SYD-2: Ypet суттєво знижений у мутантів ptp-3 (mu256), що вказує на те, що розгорнуті стани SYD-2 є більш виражений при відсутності ПТП-3. Критично важливо, що також збивання гена ptp-3 за допомогою RNAi призвело до порівнянних спостережень (рис. 3С; додатково, рис. 3). В якості контролю ми розробили нефосфорильований мутант SYD-2 Y741F, і його співвідношення FRET є порівнянним із співвідношенням Cypet: SYD-2: Ypet, вираженим у тварин дикого типу N2. Більше того, фосфомімікуюча конструкція SYD-2 Y741E призвела до співвідношень FRET, порівнянних із немодифікованою конструкцією Cypet: SYD-2: Ypet, вираженою у мутантах ptp-3 (mu256) (рис. 3B + C). Ці висновки демонструють, що SYD-2 виявляється у більш вираженій відкритій конформації за відсутності PTP-3 і що цей механізм, швидше за все, є функцією фосфатазної активності PTP-3 на тирозин 741 SYD-2.

(A) Накопичення та розподіл UNC-104 у випрямлених сегментах суббокових нейронів, взятих від різних червів у популяції та складених один на одного. (B) Розміри кластера UNC-104 у сублатеральних нейронах. (C) Густина UNC-104 уздовж суббокових нейронів. Шкала шкали: 10 мкм. Графік коробки з медіаною та похибками: ± макс. і хв. діапазон. Одностороння ANOVA з багаторазовим тестом порівняння ЛСД Фішера. **** p 750 подій. Графічні графіки з медіаною та похибками: ± макс. і хв. діапазон. Одностороння ANOVA з багаторазовим тестом порівняння LSD Фішера для UNC-104 у мутантних штамів та t-тест з корекцією Велча для RNAi та SNB-1. **** p "rel =" gallery-fragment-images-1283311614 "data-figure-caption ="

Короткий висновок результатів цього дослідження. PTP-3 знаходиться вище за SYD-2, який регулює діяльність UNC-104. PTP-3 дефосфорилює SYD-2 у положенні Y741, що призводить до внутрішньомолекулярного згортання SYD-2, який одночасно інактивує UNC-104. Навпаки, відсутність PTP-3 призводить до більш відкритих конфігурацій SYD-2, що призводить до посиленої взаємодії з UNC-104 [3], сприяючи збільшенню лісів UNC-104 вздовж аксона та активуючи UNC-104 із помітно збільшеними швидкостями. Однак STV накопичуються в сомі через знижену експресію syd-2 та unc-104 у мутантів ptp-3.

Матеріали і методи

Плазмідні конструкції та штами C. elegans

Мутантний штам ZM607 syd-2 (ok217) несе делецію більшості N-кінцевих доменів CC у гені syd-2, що призводить до нульової мутації [2]. Це видалення було підтверджено за допомогою ПЛР із використанням наступного набору праймерів: CGCGGGAATTATGCCTATTA (вперед) і TTGCATCTGCAAAAGAAACG (зворотне). Мутантний штам RB633 ptp-3 (ok244) несе делецію трьох доменів FN3, що веде до зрушення кадру та передчасного припинення ізоформи PTP-3A. Видалення було підтверджено за допомогою ПЛР із використанням наступного набору праймерів: ACCCAAACGTTACCGAACAG (вперед) та CCAGGGACTGCAGGAAAATA (в зворотному напрямку). Мутантний штам CZ3761 ptp-3 (mu256) характеризується вставкою одного нуклеотиду в екзон 25 гена ptp-3, що призводить до зсуву кадрів, що веде до передчасної зупинки при AA1777 (додаток, рис. 1) [23]. Ця вставка одного нуклеотиду була підтверджена секвенуванням, і крім того, було знайдено мутацію від G до T (в результаті кодування тієї ж амінокислоти - лейцину) чотирьох нуклеотидів вище за вищевказаною вставкою. Тим не менше, вставка одного нуклеотиду все одно повинна призвести до передчасної зупинки, що веде до нульової мутації, як описано в [23]. Зверніть увагу, що мутантні черв’яки ptp-3 (mu256) виявили фенотипи м’якого утримання яєць (додаток, рис. 2).