Ресвератрол пригнічує коліт та рак товстої кишки, пов’язані з колітом

Сянлі Цуй

кафедра фармацевтичних та біомедичних наук, медичний факультет, Університет Південної Кароліни, Колумбія, SC 29208

Ю Цзінь

Енн Б. Хофсет

Едсель Пенья

b Департамент статистики Медичного факультету Університету Південної Кароліни, Колумбія, SC 29208

Джошуа Хабігер

b Департамент статистики Медичного факультету Університету Південної Кароліни, Колумбія, SC 29208

Олександр Чуманевич

Діпак Пудял

Мітці Нагаркатті

c Кафедра патології та мікробіології Медичного факультету Університету Південної Кароліни, Колумбія, SC 29208

Пракаш С. Нагаркатті

c Кафедра патології та мікробіології Медичного факультету Університету Південної Кароліни, Колумбія, SC 29208

Удай П. Сінгх

c Кафедра патології та мікробіології Медичного факультету Університету Південної Кароліни, Колумбія, SC 29208

Лорн Дж. Хофсет

Пов’язані дані

Анотація

Вступ

Ресвератрол (3,4,5-тригідрокси-транс-стильбен) - це сполука, що зустрічається в природі, часто походить від японського (кущового) споришу, але також міститься в шкірці червоного винограду і є складовою червоного вина. Показано, що ресвератрол продовжує тривалість життя дріжджів та мишей (1). У експериментах на мишах повідомлялося про противіковий, протизапальний, протираковий, протинейродегенеративний, знижуючий рівень цукру в крові, хелатування та інші корисні серцево-судинні ефекти ресвератролу (2–7). Незважаючи на те, що ресвератрол вивчений мало у людей, він, як видається, має кардіопротекторні ефекти ex vivo (8, 9). У добових дозах, еквівалентних кількості ресвератролу у понад 1000 пляшках червоного вина, ресвератрол здається безпечним (10), але ресвератрол зазнає значного метаболізму у людини, що обмежує доступність батьківської молекули в органах, віддалених від місця всмоктування (10). Тому це особливо привабливо при вивченні захворювань шлунково-кишкового тракту.

Показано, що ресвератрол пригнічує кілька аутоімунних захворювань, включаючи експериментальний енцефаломієліт (11, 12), артрит (11), міокардит (13) та діабет (14). Здатність ресвератролу придушувати хронічні запальні захворювання, пов'язані з високим ризиком раку, такі як запальні захворювання кишечника (IBD), досліджувалась у щурів лише однією іншою групою (15, 16).

IBD складається з двох форм виразкового коліту (UC) та хвороби Крона (CD), які є динамічними, ідіопатичними, хронічними запальними станами, пов'язаними з високим ризиком раку товстої кишки (17). Звичайне лікування коліту може зменшити періоди активного захворювання та допомогти зберегти ремісію, але ці методи лікування часто приносять незначні результати, пацієнти стають тугоплавкими та мають побічні ефекти. З цієї причини багато хворих на коліт звертаються до нетрадиційних методів лікування в надії послабити симптоми активної хвороби, і, за оцінками, 40% хворих на ВЗК використовують певну форму мегавітамінної терапії трав'яними/дієтичними добавками (18, 19). Нещодавно ми показали, що екстракти гінкго білоба (EGb 761) та екстракти американського женьшеню можуть придушити коліт у мишей (20, 21). Через сильні протизапальні властивості ресвератролу ми висунули гіпотезу, що ця добавка також буде працювати проти коліту. Тут ми наводимо дані, що підтверджують такі дослідження, вказуючи на те, що ресвератрол, що вводиться в базальну дієту, пригнічує індукований DSS коліт та рак товстої кишки, пов’язаний з колітом у мишей.

Методи

Характеристики ресвератролу

Пофарбовані тканини досліджували на інтенсивність фарбування методом, подібним до описаного раніше (26). Інтенсивність фарбування на зрізах пухлини оцінювали незалежно від сліпих дослідників. Для кожного зрізу тканини відсоток позитивних клітин оцінювали за шкалою від 0 до 4 для відсотка забарвлених тканин: 0 (0% позитивних клітин), 1 (80%). Інтенсивність фарбування оцінювали за шкалою від 0 до 3: 0 - негативне фарбування, 1 - слабке фарбування, 2 - помірне фарбування або 3 - сильне фарбування. Два бали множили, в результаті чого оцінка імунореактивності (IRS) становила від 0 до 12.

Ізоляція клітин

Аналіз проточної цитометрії

Клітини селезінки, MLN та LP були свіжовиділені, як описано вище, для кожної експериментальної групи. Фарбоване флуоресценцією сортування клітин (FACS) поверхневі антигени клітин, що фарбують клітини, попередньо блокували Fc-рецепторами протягом 15 хв при 4 ° C. Клітини промивали фарбувальним буфером FACS (PBS з 1% BSA), а потім фарбували кон'югованим CY анти-CD3 (145-2C11) та кон'югованим FITC LY6G (нейтрофіли) (BD-PharMingen, Сан-Дієго, Каліфорнія) протягом 30 хв. . з періодичним струшуванням при 4 ° C. Клітини двічі промивали фарбувальним буфером FACS і повторно суспендували в розчині BD Cytofix/Cytoperm (BD-PharMingen, Сан-Дієго, Каліфорнія) протягом 20 хв. Знову клітини промивали два рази BD хімічною завивкою/промивним розчином. Для внутрішньоклітинних цитокінів повторно суспендовані фіксовані пермеабілізовані клітини фарбували заздалегідь визначеним кон’югованим антитілом до цитокінів антитілом APC (TNF-α, IFN-γ протягом 30 хв при 4 ° C у темряві). Потім лімфоцити промивали FACS ретельно фарбуючим буфером і аналізували за допомогою проточної цитометрії (FC 500 by Beckman Coulter Fort Collins Co).

Статистичний аналіз

З урахуванням запалення як кінцевої точки було проведено аналіз таблиці непередбачених ситуацій хі-квадрат на групах DSS та DSS плюс ресвератрол, щоб визначити, чи є статистично значуща різниця в їх показниках запалення. Для імуногістохімічної кількісної оцінки середні відмінності між групами порівнювали за допомогою одностороннього ANOVA з багаторазовими порівняльними тестами Шеффе. Для даних проточної цитометрії різницю між групами порівнювали за допомогою двостороннього парного t-тесту студента або непарного U-тесту Манна Уїтні. Результати аналізували за допомогою статистичної програми Statview II (Abacus Concepts, Inc., Берклі, Каліфорнія) та Microsoft Excel (Microsoft, Сіетл, Вашингтон) для комп’ютерів Macintosh. Для оцінки груп використовували однофакторні дисперсійні аналізи ANOVA. Частоту пухлин вивчали за допомогою точного критерію Фішера, який еквівалентний тесту на біноміальні пропорції. Оскільки звичайні припущення, що лежать в основі тесту ANOVA, не задовольняються, при оцінці значущості значення F-статистики з таблиці ANOVA, замість використання F-розподілу, ми використовували перестановочний розподіл для вивчення множинності пухлини. Нарешті, для порівняння середнього об’єму пухлини був використаний непараметричний тест Крускала-Уолліса. Значення Р, вибране для значимості в цьому дослідженні, становило 0,05.