Розробка нової моделі запору миші
Листування: Бін Сю, доктор філософії, професор, ключова лабораторія інтегрованої акупунктури та наркотиків, підключена до Міністерства освіти Китаю, Нанкінський університет китайської медицини, № 138 Сіаньлінь-роуд, Нанкін 210023, провінція Цзянсу, Китай. moc.anis@xuuuux
Телефон: + 86-25-86798095 Факс: + 86-25-86798095
Анотація
ЦІЛЬ: Створити нову модель запору миші.
МЕТОДИ: Тварин випадковим чином розподіляли на три групи і внутрішньошлунково вводили фізіологічний розчин 0-4 ° C (крижано-холодна група) або фізіологічний розчин 15-20 ° C (контрольна група з фізіологічним розчином) щодня протягом 14 днів, або залишали без лікування (пуста контрольна група ). Випорожнення збирали через 3–24 год після обробки для реєстрації вологого та сухого ваги та форми стільця. Проводили експерименти з кишковим рухом та вимірювали час дефекації протягом шести днів безперервно після призупинення лікування. Вирази PGP9.5 були виявлені за допомогою імуногістохімії.
РЕЗУЛЬТАТИ: На основі відсотка змін ваги стільця порівняно з вихідним рівнем (до подразнення) за 9-14 днів, зміни ваги стільця класифікували на три рівні. Кожен рівень показує різний стан тіла, це стан I (без змін: плюс-мінус 5%), стан II (трохи знижений: 5% -15%) та стан III (знижений: 15% -25%). У стані III, між 9-14 днем, вага стільця зменшився на 15% -25% порівняно з початковим рівнем і змінювався зі швидкістю> 10% порівняно з порожнім контрольним значенням, і стілець став маленьким і сухим. Крім того, функції кишечника дегенерували у цих тварин, а позитивна експресія PGP9.5 помітно знизилася в товстій кишці, клубовій кишці та мінтеріальному сплетенні товстої кишки.
ВИСНОВОК: Роздратування крижаним сольовим розчином є стабільним, повторюваним методом побудови моделі запору у мишей для вивчення патогенезу та способів лікування запору, а зміна маси та розміру стільця може слугувати корисним інструментом для оцінки успіху моделі запору чи ні.
Основна порада: Встановлення стабільних моделей тварин є дуже важливим для вивчення патогенезу захворювання для розробки стратегій профілактики та лікування. Дані попередніх досліджень показали, що періодичне та хронічне подразнення шлунку холодною водою може стримувати перистальтику шлунково-кишкового тракту. У цьому дослідженні ми дійшли висновку, що подразнення крижаним сольовим розчином мишей є стабільним, повторюваним методом побудови моделі запорів мишей.
ВСТУП
Запор, що супроводжує різні захворювання, є симптомом основних дефектів або транзиту фекальної маси через кишечник, або дефекації, часто діагностованого функціонального шлунково-кишкового розладу. Зазвичай він асоціюється з порушеннями моторики шлунково-кишкового тракту, що характеризується низкою складних шлунково-кишкових симптомів за відсутності механічної обструкції шлунково-кишкового тракту. Загальновизнано, що порушення моторики шлунково-кишкового тракту та вісцеральна парестезія становлять головну патологічну та фізіологічну основу дисфункції шлунково-кишкового тракту [1-3]. Враховуючи мізерність наявних клінічних даних, тваринні моделі повинні вивчати патогенез запору та розробляти стратегії профілактики та лікування, а також існує потреба в розробці оптимізованих моделей [4].
За останні кілька років було використано багато підходів для запорів у експериментальних тварин in vivo. Однак більша частина роботи була проведена на щурах. У порівнянні з щурами миші мають меншу толерантність і не можуть вводити тривалі подразнюючі препарати. Дослідження на мишах дають безліч переваг, включаючи економічну ефективність та наявність більшої кількості чистопородних або генетично маніпульованих (трансгенних та нокаутних) штамів. Більше того, анатомічні особливості мишей та розвиток ембріонів подібні до характеристик людей, а геноми також демонструють високий ступінь гомології [5]. Моделі мишей пропонують більшу універсальність для вивчення людських генних функцій та патогенезу захворювання, ніж моделі щурів. Отже, у цьому дослідженні ми прагнули створити стабільну модель запору у мишей, вивчити патогенез запору та вивчити кращі варіанти лікування.
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
Тварини
Мишей C57BL/6J (клас SPF, 3-тижневий самець, 20-25 г) було придбано в Модельному дослідницькому центрі тварин Нанкінського університету (Нанкін, Китай, номер ліцензії: SCXK 2013-0005). Їжа та вода були доступні за бажанням, а тварини утримувались у контрольованих умовах навколишнього середовища. Всі експериментальні маніпуляції проводились відповідно до Принципів догляду за лабораторними тваринами та Посібника з догляду та використання лабораторних тварин, опублікованого Національною науковою радою, Китай.
Групи та процедури
Мишей випадковим чином розділили на три групи: групу, оброблену сольовим розчином 0-4 ° C (крижана група, n = 30), нормальну грудну групу (пустий контроль, n = 10) та 15-20 ° C група, оброблена фізіологічним розчином (контроль сольовим розчином, n = 10), довільно пронумерована та вирощена в окремих клітках, що дозволяло нормальний доступ до їжі та води. Для полегшення відділення та збору табуретів використовували дротяну сітку. Для усунення впливу біологічних ритмів внутрішньошлункові введення проводили о 8:00 ранку один раз на день протягом 14 днів. Мишам у крижаних і сольових контрольних групах спочатку вводили або крижаний, або сольовий розчин кімнатної температури, відповідно, у дозі 0,2 мл/мишу, а потім доза збільшувалась на 0,05 мл/миші кожні 5 днів. Пустих мишей контрольної групи вирощували нормально без внутрішньошлункового введення. Зазвичай тварин вирощували та спостерігали протягом додаткових 6 днів після припинення внутрішньошлункового введення.
Збір та огляд стільця
Протягом 3-24 год після внутрішньошлункового введення стілець збирали керамічними чашками. Після забору спостерігали зміни форми стільця (розмір гранул) та реєстрували перед зважуванням. Потім кожну керамічну чашку зважували для визначення ваги мокрого середовища за допомогою електронних ваг. Після сушіння в мікрохвильовій печі (середній вогонь) протягом 6 хв чашку знову зважували для визначення сухої маси.
Вимірювання функції кишечника
Підготовка тканин
Після закінчення 14-денного втручання зразки тонкої кишки (тонка і клубова кишки) та проксимальні зразки тканин товстої кишки (приблизно 1 см в довжину) видаляли через 12 годин голодування. Кожен сегмент розкривали вздовж брижової межі і двічі промивали сольовим розчином. Коли брижові тканини та вміст кишечника видаляли, сегменти негайно фіксували зануренням у 4% параформальдегіду на 24 години. Потім їх обробляли для вбудовування парафіну у вакуумі та різали товщиною 10 мкм.
Імуногістохімія
Зрізи депарафінізували в ксилолі та гідратували в градуйованому розчині етанолу. Активність ендогенної пероксидази блокували 3% перекисом водню. Після трьох промивань 0,01 моль/л забуференного фосфатом сольового розчину (PBS; рН 7,2) неспецифічне зв’язування блокували 5% бичачим сироватковим альбуміном (BSA) протягом 30 хв при 37 ° C. Первинні антитіла до PGP9,5 (1: 1000) наносили на зрізи, і кожен зразок інкубували у вологій камері протягом ночі при 4 ° C. Слайди тричі промивали в PBS і інкубували з хріном пероксидазою (HRP) -полімерним анти-мишачим/кролячим lgG протягом 90 хв при 37 ° C. Після триразового промивання в PBS локалізацію цільового білка візуалізували інкубацією зрізів протягом 5-10 хв у свіжоприготованому розчині 3,3-діамінобензидину (DAB). Скла знову промивали, фарбували гематоксиліном і зневоднювали. Специфічність антитіла підтверджена негативним контролем за відсутності первинного лікування антитілами. Два спостерігачі оцінювали слайди за допомогою оптичного мікроскопа Olympus FV500 (Olympus, Токіо, Японія). Позитивне імунофарбування оцінювали в 5 випадкових полях зору при збільшенні 400. Середню щільність позитивного вираження оцінювали за допомогою програмного забезпечення для аналізу зображень.