Швидко дифузійні мономери p75NTR підтримують апоптоз і колапс конуса росту за допомогою нейротрофінових лігандів

Знайдіть цього автора на Google Scholar
Знайдіть цього автора на PubMed
Шукайте цього автора на цьому сайті
Запис ORCID для Стефано Луїна
Для листування: laura.marchetti @ unipi.its.luin @ sns.itantonino.cattaneo @ sns.it

Відредаговано К. Крістофером Гарсією, Стенфордський університет, Стенфорд, Каліфорнія, та затверджено 14 серпня 2019 року (отримано на огляд 17 лютого 2019 року)

Переглянути пов’язаний вміст:

Значимість

Нейротрофіни (НТ) - це гомодимерні фактори росту, що відіграють фундаментальну роль у нервовій системі. Їх діяльність походить від зв’язування та активації 3 різних типів рецепторів у мембранах нервових клітин. Рецептор p75 NT (p75 NTR) був першим виявлений у 1986 році; тим не менш, для численних структурних та функціональних аспектів, про які повідомлялося на сьогоднішній день, його механізми активації залишаються незрозумілими. Тут ми демонструємо, що його плейотропні функції регулюються різним перерозподілом рецепторів, які вирішально залежать від наявного NT та залученого субклітинного компартменту, але не пов'язані з його станом олігомеризації. Дослідження з одночастинками довели, що рецептори є мономерами з швидко дифузійною поведінкою в мембрані, що мають, щонайбільше, тимчасові самовзаємодії за шкалою мілісекунд.

Анотація

Рецептор нейротрофіну p75 (NT) (p75 NTR) відіграє вирішальну роль у збалансуванні рішень щодо виживання та смерті в нервовій системі. Проте, незважаючи на два десятиліття структурних та біохімічних досліджень, всебічна, прийнята модель активації N75 р75 лігандами NT все ще відсутня. Тут ми представляємо одномолекулярне дослідження мембрани p75 NTR у живих клітинах, демонструючи, що переважна більшість рецепторів є мономерами до і після активації NT. Цікаво, що стехіометрія та дифузійні властивості дикого типу (wt) p75 NTR майже ідентичні властивостям мутанта рецептора, у якого відсутні залишки, раніше вважалося, що індукують олігомеризацію. Wt p75 NTR та мутовані (mut) p75 NTR відрізняються своїм розподілом у багатих холестерином областях мембрани при стимуляції фактора росту нервів (NGF): Ми стверджуємо, що це походження здатності wt p75 NTR, але не мута p75 NTR для опосередкування незрілого апоптозу, спричиненого NT (proNT). Обидві форми p75 NTR підтримують втягування конуса зростання, викликаного proNT: ми показуємо, що накопичення поверхні рецептора є рушійною силою колапсу конуса. Загалом, наші дані розкривають багатогранну активність мономеру p75 NTR і дозволяють забезпечити узгоджену інтерпретаційну систему існуючих суперечливих даних у літературі.

Тут ми безпосередньо та кількісно оцінюємо статус олігомеризації p75 NTR у плазматичній мембрані живих клітин за допомогою одномолекулярної флуоресцентної мікроскопії з мінімально інвазивною стратегією (21, 22); це покладається на вставку короткої пептидної мітки в білок p75 NTR та його маркування стехіометрією 1: 1 (23, 24). Цей метод також дозволяє зобразити рецептор невеликими органічними барвниками, що, на відміну від більш громіздких квантових точок (Qdot), дозволяє отримати олігомерний стан рецептора з їх інтенсивності флуоресценції (21). Ми показали, що мембрана p75 NTR є переважно швидкодифузійним мономером, незалежно від стимуляції NT. Його самовзаємодія є надто транзиторною, щоб привести до значної ди- або тримеризації рецепторів; важливо, що вони не залежать від Cys256 або від інших залишків, які раніше пропонувались грати роль в олігомеризації рецепторів. Ми також збираємо докази того, чому мутант p75 NTR C256A не викликає NT-залежного апоптозу (18), але є функціональним для сигналізації колапсу конуса росту (20). Вирішивши це очевидне протиріччя, ми переглянемо тут функцію p75 NTR у концептуальних рамках універсального мономерного рецептора.

Результати

Експресія, валідація та мембранне фторологічне маркування конструкцій людини p75 NTR.

p75 NTR Одиночні молекули дифузують як мономери в клітинній мембрані.

Мембранна динаміка молекул N75 р75 у клітинній мембрані. (A) Експресія S6-p75 NTR, регульована доксицикліном (докси). Зображення TIRF мічених Abberior635P мічених рецепторів N75 р75 у клітинах SK-N-BE (2) показують залежність кількості рецепторів на площу (синя шкала) від концентрації доксицикліну в середовищі (значення чорного нижче). (Шкала шкали, 5 мкм.) (B) Зображення TIRF S6-p75 NTR, позначене Abberior635P; накладені траєкторії позначені синім кольором. (Шкала шкали, 5 мкм.) (C) Конструкції з позначкою S6. Маса p75 NTR така, як на фіг. 1А; mut p75 NTR має мутації C256A та G256I, і йому не вистачає залишків з 221 по 246, що охоплюють домен O-стебла в області JM; і dim p75 NTR має залишки від 213 до 251 частини JM, замінені доменом лейцинової блискавки (LeuZIP) з c-jun. CD, чоппер; DD, домен смерті; SP, сигнальний пептид. (D) Розподіл D для wt p75 NTR (сірий), mut p75 NTR (чорний) та неяскравий p75 NTR (синій). (E) Кількість подій M&S у 500-кадрових фільмах, нормоване на площу мембрани, для wt p75 NTR (сірий), mut p75 NTR (чорний) та неяскравий p75 NTR (синій). Коробки представляють SE, лінії - серединну, а вуса - SD. *** P NTR (сірий), mut p75 NTR (чорний) і неяскравий p75 NTR (синій) конструкції. Для цих аналізів розглядали клітини з 0,18-0,36 рецепторами на діапазон квадратних мікрометрів.

Через тимчасовий характер димерів p75 NTR, а також фотовідбілювання під час відстеження, аналіз середньої інтенсивності траєкторій у живих клітинах не може дати однозначної відповіді на стехіометрію (Додаток SI, рис. S5). Тому ми проаналізували профіль інтенсивності фотовідбілювання ізольованих плям p75 NTR/Abberior635P у нерухомих клітинах (жовті рамки на рис. 3А). Для кожного плями ми визначили 1) кількість етапів фотовідбілювання (червоні стрілки на рис. 3B) і 2) середню інтенсивність перед відбілюванням (IPRE; зелені лінії на рис. 3B). Обидва вони є прямим показником кількості молекул в плямі для олігомеризації рецепторної мембрани (37). Переважна більшість аналізованих мас p75 NTR та mut p75 NTR є мономерами; тобто вони демонструють 1 етап вибілювання (приблизно 77% для обох видів; рис. 3С). І навпаки, стимульована NGF конструкція S6-TrkA демонструвала значно більшу частку димерів та олігомерів (26) (Додаток SI, рис. S6A). Важливо, що більшість тьмяних плям N75 рН демонстрували 2-ступінчастий профіль фотовідбілювання (55%; рис. 3С), а мономери були зменшені до 35%. Тільки неяскравий p75 NTR відображав значну кількість плям з 3 та 4 кроками фотовідбілювання. Розподіли IPRE, отримані для варіантів 3 p75 NTR, підтвердили аналіз етапу відбілювання (Додаток SI, рис. S6B).

p75 NTR - це переважно мономер у клітинній мембрані. (A) Зображення TIRF, що показує рецепторні плями на поверхні нерухомих клітин (жовті квадрати представляють аналізовані плями; аналізовані клітини мали від 0,2 до 0,5 плями на квадратний мікрометр). (Шкала шкали, 1 мкм.) (B) Типові сліди профілю інтенсивності мономеру (вгорі), димеру (в середині) та тримеру (внизу), що відображають параметри, враховані при розрахунку. IPRE (зелена лінія) - це середня інтенсивність частинок перед першим кроком відбілювання, червоні стрілки вказують на окремі етапи фотовідбілювання, а сіра лінія відображає інтенсивність фону. а.у., довільні одиниці. (C) Крок фотовідбілювання на трасування для wt p75 NTR, mut p75 NTR і dim p75 NTR .

Ми підкреслюємо, що було виявлено деякі видимі димери mut p75 NTR (близько 20% аналізованих плям), подібні до wt p75 NTR: Це доводить відсутність взаємозв'язку із залишками ТМ, раніше зазначеними як димеризація рушійних рецепторів (17). Загалом, наші експерименти розрізняють дифузійність мономерів та димерів і ставлять під сумнів існування стабільних димерів p75 NTR в мембрані живих клітин.