Синтез РНК флавівірусу in vitro

Радхакрішнан Падманабхан

1 Кафедра мікробіології та імунології, Медичний факультет Університету Джорджтауна, Вашингтон, округ Колумбія, 20057

Ратрі Тахампуня

1 Кафедра мікробіології та імунології Медичної школи Університету Джорджтауна, Вашингтон, округ Колумбія, 20057

Тадахіса Терамото

Кюнг Х. Чой

2 Кафедра біохімії та молекулярної біології Медичного відділення Техаського університету, Галвестон, Техас 77555-0156

Резюме

Створення систем in vitro для вивчення механізмів синтезу РНК для вірусів з позитивною ланцюгом РНК було дуже корисним у минулому і пролило світло на склад білків та компонентів РНК, оптимальні умови, природу продуктів, що утворюються, цис-діючу РНК елементи та транс-діючі білкові фактори, необхідні для ефективного синтезу. У цьому огляді ми узагальнюємо наше сучасне розуміння щодо вимог до синтезу РНК флавівірусу in vitro. Ми описуємо деталі умов реакції, специфіку матриці, що використовується або багатокомпонентним мембранно-зв’язаним комплексом вірусної реплікази, або очищеною, рекомбінантною РНК-залежною РНК-полімеразою. Ми також обговорюємо перспективи майбутнього, щоб розширити межі наших знань.

1. Вступ

1.1. РНК ДЕНВ

2. Синтез РНК in vitro за допомогою ендогенних вірусних шаблонів РНК у зв’язаних з мембраною комплексах реплікації

2.1. Вступ

Флавівіруси мають широкий діапазон господарів і можуть розмножуватися в різних клітинах ссавців та комарів. Повідомлялося, що хоча альфавірус, вірус Sindbis, може розмножуватися та продукувати вірусоспецифічні антигени в клітинах енюклейованих курячих ембіо, вірус японського енцефаліту (JEV) не зміг цього продукувати, і ядерна участь протягом принаймні 2–4 години після зараження потрібен був синтез антигену, специфічного для вірусу [38]. Роль ядра для цієї вимоги не зрозуміла.

Мембрани ендоплазматичного ретикулуму (ER) безпосередньо беруть участь у трансляції та реплікації вірусів у цитоплазмі. Насправді дослідження з використанням електронної мікроскопії та тривимірних методів електронної томографії показали, що реплікація вірусу відбувається у зв’язаних з мембраною комплексах реплікації в індукованих вірусом та розширених мембранних відділеннях ER [39, 40]. Комплекси реплікації, зв’язані з мембраною, із заражених флавівірусом клітин аналізували на склад вірусних видів РНК за кількома групами. РНК розміром генома 40–44S має ковпачок типу 1 на 5′-кінці, але не має полі (А) на 3′-кінці [1, 41–44]. Крім того, також спостерігалися дволанцюгові РНК 20–22S та гетерогенні 20–28S РНК, імовірно реплікативна форма (RF) та реплікативні проміжні продукти (RI) [45–48], а також менші РНК 8–12S РНК у флавівірусі -інфіковані клітини [1]. Було зроблено висновок, що цей малий вид РНК був продуктами деградації вірусних РНК [49], оскільки повідомлялося, що в попередньому дослідженні не було доказів активності малих РНК у формі [1]. У світлі сучасних знань, малі види РНК, ймовірно, можуть включати субгеномну РНК, яка, як повідомляється, є неповною деградацією вірусної геномної РНК клітинними РНКазами [50]. Було показано, що ця невелика РНК має важливе значення для цитопатичності та патогенності WNV [50, 51].

2.2. Ранні системи для вивчення реплікації вірусів in vitro

Ідея про те, що клітинні мембрани відігравали важливу роль у (+) життєвому циклі вірусу РНК, включаючи реплікацію, була відома принаймні з кінця 1960-х до початку 1970-х [52, 53]. Наприклад, синтез пікорнавірусної РНК ініціюється гладкою мембранною фракцією із значенням седиментації 130 S при градієнтному градієнтному ізофікному сахарозі, яке потім дозріває до комплексу пізньої реплікації з 250 S-структур. Комплекс реплікації складався з вірусної РНК-полімерази, ssRNA, реплікативної форми 20 S та 26 S (RF) та реплікативної проміжної (RI) форми вірусної РНК відповідно [53, 54]. У попередніх дослідженнях ендогенний мембранно-реплікаційний комплекс був охарактеризований при синтезі вірусної РНК Куреші та Трент з використанням клітин BHK-21, інфікованих вірусом енцефаліту Сент-Луї (SLE) [55], та Zebovitz et al. з використанням інфікованих JEV клітин свинячих нирок, PS (Y-15) [47, 48]. Для характеристики видів РНК у цитоплазматичних мембранних структурах, що осідають при 250 S, інфіковані SLE клітини BHK-21 у присутності актиноміцину маркували пульсом міченим [3 H] уридином протягом 30 хв через 16 год після зараження [ 55]. Мембранні структури 250 S, які містили