Сталевий фактор контролює виживання та рухливість зародкових клітин з моменту їх виникнення

Резюме

ВСТУП

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

Розведення мишей, підготовка ембріонів та генотипування

Культура зрізних ембріонів

Ембріони E7.25 та E7.5 розрізали на половинки вздовж сагітальної осі за допомогою скальпеля. Половину кожного ембріона поміщали на вставку культивованих клітин органу міліліметрії CM (Millipore), попередньо покриту колагеном IV (BD), а другу половину використовували для генотипування. Для ембріонів E9.0 хвостові половинки культивували на вставках, як описано раніше (Molyneaux et al., 2001). Потім вставки міліцеліального органу поміщали в металеву підставку, що містила камери зі скляним дном, та інкубували в 600 мкл середовища, забуференного Hepes DMEM/F-12 (Gibco), з 0,04% безліпідної BSA та 100 ОД/мл пеніциліну/стрептоміцину (Гібко). Для генерування гострої втрати сигналу Steel в антисептичне культуральне середовище додавали 10 мкг/мл блокуючого c-Kit антитіло Ack2 (добрий подарунок від д-ра Фреда Фінкельмана, CCHMC). В якості контролю використовували мишачий IgG (10 мкг/мл, Jackson ImmunoResearch). Зрізи ембріонів підтримували при температурі 37 ° C, поміщаючи металеву підставку в температурно контрольовану сцену (Zeiss) і підтримуючи вологість вологими паперовими рушниками, поміщеними в 100-міліметрову посудину для культури, закріплену над камерами для культури органів.

сталевий

Аналіз проміжок часу мігруючих PGC

Зрізи знімали за допомогою конфокальної системи Zeiss LSM510, прикріпленої до аксіовертного мікроскопа Zeiss. Зображення отримували кожні 5 хвилин протягом 6 - 10 годин, а фільми аналізували, використовуючи зображення NIH, як описано (Molyneaux et al., 2001). Коротко, було відстежено всі клітини, які залишались у фокусі на час зйомок, а середню швидкість, максимальну швидкість та зміщення вимірювали для кожної з цих клітин за допомогою двох макросів для відстеження клітин, написаних для програмного забезпечення NIH ImageJ Кеті Моліно або Ерік Мейєрінг. Також було зафіксовано їх спрямованість, а чиста траєкторія руху всіх клітин кожного ембріона побудована на діаграмі вітряної рози. Експерименти повторювали принаймні три рази, а також аналізували від трьох до восьми ембріонів на групу. Для статистичного порівняння дані аналізували за допомогою непарного двостороннього t-критерію Стьюдента з однаковими дисперсіями.

RT-PCR

Для RT-PCR-аналізу аллантоїди з ембріонів E7.5 та генітальні гряди з ембріонів E10.5 розтинали, а РНК виділяли з розсічених тканин за допомогою набору RNeasy Kit (Qiagen). РНК (10 нг) транскрибували зворотним шляхом із використанням систем першого ланцюга синтезу Superscript III (Invitrogen), дотримуючись рекомендацій виробника. ПЛР-реакції проводили за допомогою Redmix Plus (GeneChoice). Були використані такі праймери: сталевий фактор, зв’язаний з мембраною, F-5′-TCCCGAGAAAGGGAAAGC-3 ′, R-5′-CTGCCCTTGTAAGACTTGACTG-3 ′ (передбачувана довжина фрагмента, 149 bp); коефіцієнт розчинної сталі, F-5′-TTATGTTACCCCCTGTTGCAG-3 ′, R-5′-CTGCCCTTGTAAGACTTGACTG-3 ′ (передбачувана довжина фрагмента, 195 п.н.).

Імунофлуоресцентний аналіз на цілих зародках або заморожених зрізах

Ембріони фіксували у 4% параформальдегіді (PFA). Потім для зафарбовування цілих зондів ембріони промивали 0,5% NP-40 (2 × 10 хвилин), блокували в PBSST (PBS/0,3% Triton X-100 з 5% козячих або ослиних сироваток, 2 × 1 години промивань) і інкубували протягом ночі при 4 ° C в PBSST з первинним антитілом. Наступного дня ембріони промивали в PBST (PBS/0,3% Triton X-100, 2 × 15 хвилин, потім 3 × 1 година) при 4 ° C, інкубували протягом ночі при 4 ° C в PBSST з Cy3- або Cy5- кон'юговані вторинні антитіла (Jackson ImmunoResearch), промивали в PBST (2 × 15 хвилин, потім 3 × 1 годину) і очищали 50%, потім 90%, гліцерином для візуалізації. Ембріони, що підлягали розділенню, зневоднювали в сахарозі і монтували в сполуку ОСТ (Tissue-Tek) для кріосекції. Розділені ембріони регідратації PBST (10 хвилин), блокування PBSST (1 година при кімнатній температурі) та інкубація з первинним антитілом протягом ночі при 4 ° C. На наступний день предметні стекла промивали PBST (3 × 15 хвилин), інкубували в PBSST із вторинним антитілом (2 години), промивали PBST (2 × 15 хвилин) і монтували DABCO (Sigma) для візуалізації.

РЕЗУЛЬТАТИ

Фактор сталі виражається клітинами, що оточують PGC протягом усієї міграції

Як показано на рис. 1B, C, локалізований у клітині мембрана сталевого фактора спостерігався в алантої при E7.5. Для підтвердження присутності в аллантоїсі мембранно-зв’язаного сталевого фактора ми зафіксували ембріони Е7,5 з 2% трихлороцтовою кислотою (ТСА), що дало кращу перехресну реакцію з антитілом до фактора сталь. Фіксація TCA спричиняє втрату сигналу GFP, тому PGC не вдалося ідентифікувати. Однак група клітин в ядрі алантоїсу показала сильне мембранне забарвлення фактора сталі (рис. 1J, стрілка). Ми також розібрали алантоїди з ембріонів E7.5 та провели RT-PCR із застосуванням праймерів, які розрізняють мембранно-розчинні та розчинні фактори сталі. Результати RT-PCR підтвердили присутність як розчинного, так і зв’язаного мембраною сталевого фактора в алантої при Е7,5 (рис. 1К).

PGC спочатку експресують стеллу в позазародковому алантоїсі і мігрують проксимально в задній епібласт

Проміжок часу для ембріонів E7.25 та E7.5 Stella-GFP. (A) Три кадри при t = 0, t = 78 хвилин і t = 156 хвилин фільму, розпочатого в E7.25. При t = 0 PGC, виявлені експресією Stella (зелений), видно в алантоїсі (AL). Залишковий вираз Стелли також спостерігається в інших місцях ембріона. PGC починають поширюватися вниз до епібласту. Стрілка вказує приблизну межу між аллантоїсом і проксимальним епібластом. () Три кадри при t = 0, t = 280 хвилин і t = 560 хвилин відео, розпочатого в E7.5. PGC переміщуються з аллантоїса в задній епібласт ембріона протягом періоду фільму. Стрілка вказує приблизну межу між аллантоїсом і проксимальним епібластом. Популяція PGC розширюється до проксимального епібласту. Стрижні шкали: 100 мкм.

Нещодавня робота в нашій лабораторії показала, що втрата сталевого фактора призводить до апоптозу PGC, починаючи з або раніше E9.0, який можна врятувати видаленням проапоптотичного білка Bax (Runyan et al., 2006). Тому ми досліджували ембріони зі схрещувань Steel/Bax при E7.5. У п'яти досліджених зародках Bax +/-, Steel -/- втрата одного алелю Bax врятувала зменшення кількості PGC у зародків Steel -/- при E7.5 (рис. 3A). У сталевих -/- ембріонів кількість PGC зросла з 15 ± 4,3 до 29 ± 9,3 (P = 0,041) за відсутності одного алелю Bax. Зразки ембріонів, з яких проводили ці підрахунки, показані на рис. 3B. Ці дані показують, що сталевий фактор є важливим фактором виживання для PGC ще до того, як вони потрапляють в задню кишку, і що PGC гинуть через залежний від Bax апоптотичний шлях при E7,5, коли їм не вистачає сталевого фактора. Дані також виключають можливість того, що сталевий фактор необхідний для початкової специфікації PGC, оскільки кількість PGC збільшувалась у сталево-нульових ембріонах, коли гальмувався апоптоз.