Тромбопоетин і тромбін викликають фосфорилювання тирозину Vav у крові тромбоцитів крові людини

  • Розділений екран
  • Поділитися піктограмою Поділіться
    • Facebook
    • Twitter
    • LinkedIn
    • Електронна пошта
  • Значок Інструменти Інструменти

    • Йосітака Міякава, Ацусі Ода, Брайан Дж. Друкер, Кацутосі Озакі, Макото Ханда, Хідея Охаші, Ясуо Ікеда; Тромбопоетин та тромбін викликають фосфорилювання тирозину Vav у тромбоцитах крові людини. Кров 1997; 89 (8): 2789–2798. doi: https://doi.org/10.1182/blood.V89.8.2789

      тромбін

      Завантажити файл цитування:

      Анотація

      Основна увага в цьому звіті приділяється протоонкогенному продукту Vav, білку на 95 кД, що в основному експресується в гемопоетичних клітинах. 10-20 Чи важливим є Vav у кровотворенні - суперечливе питання. 17-20 Однак нещодавній звіт припускає, що Vav може бути необхідним для еритропоезу дорослих. 21 Відомо, що множинні цитокіни та гемопоетичні фактори росту індукують фосфорилювання тирозину Vav. 10-16 Крім того, кілька звітів вказують на те, що Vav відіграє важливу роль у передачі сигналів через Т- і В-клітинні антигенні рецептори в лімфоїдних клітинах. 22-24

      Враховуючи наявність на тромбоцитах функціональних рецепторів тромбопоетину та існування білків від 95 до 85 кД як основних фосфорильованих білків тирозину після стимуляції тромбоцитів тромбопоетином, 2 ми дослідили, чи можуть тромбоцити мати білок Vav, і якщо він стає фосфорильованим тирозином після обробки тромбопоетин. Ми показали, що тромбопоетин викликає збільшення фосфорилювання тирозину Vav у тромбоцитах без підвищення концентрації цитозольного іонізованого кальцію ([Ca 2+] i) або активації протеїнкінази C. Тромбін, U46619, колаген або форбол 12-міристат 13 ацетат (РМА), всі з яких, як відомо, активують протеїнкіназу С, 25 також індукують збільшення фосфорилювання тирозину Vav. Тромбін викликає перерозподіл Vav у нерозчинний залишок Triton X-100 залежно від агрегації. Нарешті, подібно до багатьох білків, включених до нерозчинного залишку Triton X-100 після агрегації тромбоцитів, таких як інтегрін β3, p60 c-src, талін та актин-зв’язуючий білок, ми виявили, що Vav є ендогенним субстратом кальпаїну, припускаючи, що Vav може відігравати роль у подіях післягрегації. 26-34

      МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

      Підготовка тромбоцитів. Кров людини у здорових добровольців відбирали шляхом венепункції в 1/10 об'єму 3,8% (мас./Об.) Тринатрієвого цитрату і обережно перемішували. Багату тромбоцитами плазму (PRP) готували центрифугуванням цільної крові при 200g протягом 20 хвилин та аспірацією PRP. PRP інкубували з аспірином (2 ммоль/л) протягом 30 хвилин при кімнатній температурі. PGE1 (1 мкмоль/л) додавали із вихідного розчину в абсолютному етанолі (1 ммоль/л). PRP обертали на 800 г, утворюючи м'яку гранулу тромбоцитів. Гранулу ресуспендували в 1 мл модифікованого буфера HEPES-тироду (129 ммоль/л NaCl, 8,9 ммоль/л NaHCO3, 0,8 ммоль/л KH2PO4, 0,8 ммоль/л MgCl2, 5,6 ммоль/л декстрози та 10 ммоль/л HEPES, рН 7,4), що також містить апіразу (2 ОД/мл) і промивають двічі. Тромбоцити ресуспендували в тому ж буфері при концентрації 3 × 10 8 клітин/мл за допомогою апірази (2 ОД/мл), що містить 1 ммоль/л CaCl2 при 37 ° C.

      Клітинні лінії. Тромбопоетинозалежна клітинна лінія (FDCP-hMpl5) була попередньо встановлена ​​шляхом трансформації клітин FDCP-2 експресійною плазмідою, що містить кДНК людської c-mpl у повному розмірі, керовану тривалим кінцевим повторенням вірусу саркоми миші Молоді. 3,37,38 Перед обробкою клітин реагентами їх інкубували в IMDM, що містить 10% фетальної телячої сироватки (FCS) без екзогенного інтерлейкіну (IL) -3 протягом 6 годин. Після двох промивань їх інкубували в сольовому розчині, забуференному фосфатом (PBS; pH 7,4).

      Імунопреципітація. Стимуляцію клітин припиняли додаванням рівної кількості буфера для лізису (15 ммоль/л HEPES, 150 ммоль/л NaCl, 1 ммоль/л PMSF, 10 ммоль/л EGTA, 1 ммоль/л ортованадата натрію, 0,8 мкг/мл лейпептину, 2% Тритон Х-100 (об/об), рН 7,4). Через 20 хвилин на льоду лізати центрифугували при 10000 g (при 4 ° C) протягом 20 хвилин. Надосадову рідину видаляли та інкубували з імунною сироваткою та білком А-сефарозою (40 мкл 50% -ної суспензії) протягом 1 години. Потім додавали бажані поліклональні або моноклональні антитіла та інкубували протягом 2-3 годин на льоду. Додавали білок A-сефарозу або кон'юговану IgG агарозу (40 мкл 50% -ної суспензії) та інкубували протягом декількох годин. Імунні комплекси промивали 1 мл холодного буфера для промивання (15 ммоль/л HEPES, 150 ммоль/л NaCl, 1 ммоль/л PMSF, 10 ммоль/л EGTA, 1 ммоль/л ортованадата натрію, 0,8 мкг/мл лейпептину, 1% Triton X-100 [об./Мас., РН 7,4) три рази, а потім ресуспендували в буфері зразків Леммлі.

      Виділення оперативно визначеного цитоскелета тромбоцитів. Нерозчинний цитоскелет Triton X-100 був виділений, як описано з наступною модифікацією. 36 Коротко, рівна кількість буфера для лізису (15 ммоль/л HEPES, 150 ммоль/л NaCl, 1 ммоль/л PMSF, 10 ммоль/л EGTA, 1 ммоль/л ортованадата натрію, 0,8 мкг/мл лейпептину, 2% тритону Х-100 [об./Мас.], РН 7,4) додавали до суспензій тромбоцитів для солюбілізації тромбоцитів. Через 5 хвилин на льоду лізати центрифугували при 10000 г. Отриману гранулу промивали двічі промивним буфером (145 ммоль/л NaCl, 0,1 ммоль/л MgCl2, 0,5 ммоль/л PMSF, 5 ммоль/л EGTA, 1 ммоль/л ортованадата натрію, 0,4 мкг/мл лейпептину, 1% [ об./мас.] Тритон-Х 100, рН 7,4). Для одновимірного електрофорезу SDS нерозчинний залишок Triton X-100 розчиняли в буфері зразків SDS. Надосадову рідину розбавляли рівним об'ємом двічі концентрованого буфера зразка SDS.

      Завантаження тромбоцитів 32 Pi та аналіз фосфорильованих білків. Виявлення фосфорилювання легкого ланцюга міозину та плекстрину проводили, як описано з наступними модифікаціями. 40 Гранули м’яких тромбоцитів, приготовані, як описано вище, ресуспендували у модифікованому буфері HEPES-тироду без KH2PO4, але з апіразою (2 ОД/мл) та інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі. Промиті тромбоцити готували, як описано вище. Лізат тромбоцитів готували та аналізували на 7,5% - 15% SDS-PAGE. 39 Гелі сушили та авторадиографували на плівках X-Omat (Eastman Kodak, Рочестер, Нью-Йорк).

      РЕЗУЛЬТАТИ

      Для визначення наявності Vav у тромбоцитах людини використовували специфічні антисироватки проти Vav. Ці антисироватки розпізнають смугу 95 кД в лізатах тромбоцитів людини, яка поєднується з смугою 95 кД в лізатах клітин Jurkat, які експресують Vav, вказуючи на те, що тромбоцити мають Vav (дані не наведені). 41-43 Як і в інших гемопоетичних клітинах, ми виявили, що Vav конститутивно асоціюється з Grb2, адаптерним білком SH2/SH3 (дані не наведені) .11,44

      Ми дослідили, чи Vav стає фосфорильованим тирозином у тромбоцитах, оброблених тромбопоетином. Тромбоцити, оброблені тромбопоетином (100 нг/мл) протягом різного часу, лізували в буфері, що містить 1% Triton X-100, і імунопреципітували специфічними антисироватками Vav. Стільки ж 95-кД білка, визнаного антисиворотками Vav, було імунопреципітовано з усіх клітинних лізатів (рис. 1А, нижня панель). Після лікування тромбопоетином цей самий білок дедалі частіше фосфорилювався тирозином на низькому базальному рівні (рис. 1А, верхня панель). Таким чином, тромбоцити мають Vav, який стає фосфорильованим тирозином після лікування тромбоцитами людини тромбоцитів. Тромбін (1 од/мл), колаген (10 мкг/мл) або U46619 (1 мкмоль/л), міметик тромбоксану, також індукують фосфорилювання тирозину Vav у тромбоцитах (рис. 1В та С). Слід зазначити, що ми регулярно додаємо пептид RGDS (200 мкг/мл) до суспензій тромбоцитів та мінімізуємо перемішування в присутності агоністів, щоб зменшити ефекти зв’язування фібриногену з α IIbβ3 та подальшої агрегації, які суттєво впливають на фосфорилювання тирозину білка тромбоцитів.34, 45