Відкриття білків сироваткового біомаркеру при важкій прееклампсії шляхом протеомічного аналізу

Анотація

Прееклапсія (ПЕ) є важким розладом, що виникає під час вагітності, що призводить до захворюваності та смертності матері та плоду. ТЕЛА вражає приблизно 3-8% усіх вагітностей. У цьому дослідженні ми провели рідинну хроматографію з масовою спектрометрією/мас-спектрометрією (LC-MS/MS), щоб проаналізувати зразки сироватки, виснажені з шести найбільш поширених білків при нормальних вагітностях та вагітності, уражені РЕ, для профілактики сироваткових білків. Всього було впевнено ідентифіковано 237 білків

Вступ

Прееклампсія (ПЕ) - це розлад, що визначається новою гіпертензією та протеїнурією після 20 тижнів гестації та може проявлятися вже через 4-6 тижнів після пологів. ТЕЛА вражає 3-8% усіх вагітностей і є основною причиною материнської захворюваності та смертності (Noris et al., 2005). Однак основний патогенез гестозу залишається невідомим, і розробка адекватних біомаркерів для його діагностики та прогнозу ще не розроблена (Jauniaux et al., 2006). Загалом ПЕ характеризується наступним чином: 1) протягом раннього періоду вагітності плацента вивільняє кілька факторів росту в кровообіг матері, викликаючи надмірне системне запалення у відповідь на ішемічну гіпоксію та окислювальний стрес (Borzychowski et al., 2006). 2), генералізована дисфункція ендотелію призводить до характерних для матері симптомів прееклампсії, таких як гіпертонія та протеїнурія протягом пізнього періоду вагітності (Taylor, 1997). Незважаючи на те, що ТЕЛА досліджувались давно, в даний час не існує надійних біомаркерів для прогнозування ТЕЛА на ранніх термінах вагітності.

Останнім часом багато груп приділяють особливу увагу сироватковим білкам, пов’язаним з ожирінням, запаленням низького ступеня та гіпертриацилгліцеролемією, які є загальними симптомами ПЕ (Smets et al., 2006). Вважається, що різні білки сироватки сприяють появі симптомів ПЕ, такі як фактор росту плаценти (PlGF), фактор росту судинного ендотелію (VEGF), розчинний рецептор-1 фактора росту ендотеліального судинного судин (sVEGFR-1), розчинна fms-подібна тирозинкіназа -1 (sFlt-1), плацентарний білок 13 (PP-13), пов'язаний з вагітністю білок плазми A (PAPP-A), хоріонічний гонадотропін людини (HCG), розчинний ендоглін (sEng), альфа-фетопротеїн (AFP), інсулін, подібний фактор росту-1 та IGF-зв’язуючий білок-1 (IGFBP-1) (Muller et al., 1996; Bersinger and Odegard, 2004; Audibert et al., 2005; Venkatesha et al., 2006; Baumann et al., 2007; Спенсер та співавт., 2008; Тейшейра та ін., 2008).

Різні дослідження показали, що рівні експресії цих білків збільшуються або зменшуються відповідно до розладу та його ступеня в ПЕ (Baumann et al., 2007). Однак невідомо, чи ці білки будуть служити новими маркерними білками для діагностики ПЕ в клінічній практиці. Оскільки ці білки мають відносно низьку специфічність для захворювання, необхідний подальший розвиток для його клінічного застосування.

Щоб забезпечити комерційне використання, необхідно подолати такі проблеми, як валідація, відтворюваність та специфічність щодо нових маркерних білків. Крім того, аналіз біологічної рідини, яка має високу складність та динамічний діапазон, вимагає детальної попередньої підготовки та більш чутливих методів (Hu et al., 2006).

З цих причин у цьому дослідженні ми систематично порівнювали протеоми материнської сироватки у жінок з ПЕ та нормальною вагітністю, використовуючи протеомічні технології на основі LC-MS після виснаження дуже великих кількості сироваткових білків, таких як альбумін, імуноглобулін та перенесення тощо. з 237 білків сироватки крові були впевнено ідентифіковані за зразками сироватки жінок з ПЕ та нормальним показником показника помилкового виявлення 1% (FDR). Серед них 97 білків, що мають кілька унікальних пептидів, було збережено для групового порівняння. Диференціальні рівні експресії вибраних білків перевіряли за допомогою кількісного мас-спектрометричного методу, селективного моніторингу реакцій (SRM) (Ji et al., 2003) та імуноферментного аналізу (ELISA).

Результати

Видобуток нових біомаркерів з біологічних рідин людини ставить багато проблем, які необхідно подолати за допомогою протеомічного підходу, таких як широкий динамічний діапазон в достатку та складність білкових компонентів. Відповідно, були зроблені різні спроби відкрити нові білки маркерів з клінічними значеннями (Whiteaker et al., 2007). У цьому документі ми намагалися ідентифікувати нові маркери білків для PE, використовуючи LC-MS/MS, залежні від даних, як для ідентифікації, так і для напів кількісного визначення. Рівень експресії диференційовано експресованих білків додатково підтверджували методом мас-спектрометричного кількісного визначення, SRM та ELISA.

Ми проаналізували окремі зразки сироватки від п’яти пацієнтів на групу в двох примірниках методом LC-MS/MS для виявлення білків сироватки (табл. 1). У цьому аналізі зібрані зразки сироватки обробляли за допомогою колони з множинним видаленням спорідненості (MARS), що містить шість антитіл проти альбуміну, IgG, IgA, трансферину, гаптоглобіну та альфа-1-антитрипсину (Ryu et al., 2010). Після великого рясного виснаження білка зразки сироватки перетравлювали за допомогою трипсину послідовності для аналізу LC-MS/MS для порівняння сироваткових протеом у жінок з ПЕ та у жінок, які переносять нормальну вагітність.

Отримані спектри MS/MS шукали за допомогою алгоритмів SEQUEST, використовуючи стратегію складеної бази даних приманки, щоб оцінити довіру пептиду (Ballif et al., 2005). Ми отримали 5984 та 5744 спектри MS/MS з групи PE (n = 5) та нормальної групи (n = 5), відповідно. У цілому 237 білків з 1% FDR були віднесені до цих спектрів (рис. 1А). Ми обмежили позитивний набір білків білками, ідентифікованими множинними пептидами. Серед них 97 білків відповідали 2 ≤ унікальним пептидам (рис. 1В) (табл. 2), і вони були піддані подальшим анотаціям та валідації. Отже, ми ідентифікували 85 білків та 90 білків, що утворюють зразки сироватки ПЕ та зразки сироватки крові нормальної вагітності відповідно. Серед 85 білків, ідентифікованих у групах ПЕ, 49 білків було виявлено у всіх п'яти пацієнтів. Крім того, 49 білків було виявлено у всіх п'яти пацієнтів серед 90 білків, визначених у нормальній групі.

біомаркеру

Діаграма Венна Ідентифікованих білків з обох груп; (А) показує білки, ідентифіковані з одним пептидним попаданням. Всього 111 білків, спільних між групою PE та NC. (В) являє собою білки, які мають кілька унікальних пептидів. В обох групах було поділено сімдесят вісім білків.

Серед 97 достовірно ідентифікованих білків 78 було виявлено в обох групах. Для скринінгу потенційних біомаркерів, специфічних для кожної групи, відносні рівні експресії ідентифікованих білків порівнювали напівкількісним аналізом на основі спектрального підрахунку (Choi et al., 2008; Little et al., 2010). Врешті-решт 62 білки показали більш ніж 1,2-кратну різницю в рівнях експресії, 27 з яких регулювались вгору, а 35 з них регулювались вниз відповідно до їх спектральної кількості (Таблиця 3).

Ці білки, ідентифіковані в процесі профілювання з 1% FDR, були додатково анотовані на основі їх молекулярної функції та біологічного процесу відповідно до термінів генної онтології (GO) у порівнянні з контрольним сироватковим протеомом, отриманим у результаті проекту плазмових протеомів HUPO (Adamski et al., 2005; Omenn et al., 2005) з використанням інструменту функціональної анотації пантери (Thomas et al., 2003).