Відвар Bu-Fei та модифікований відвар Bu-Fei пригнічують ріст недрібноклітинного раку легенів,
Пов’язані дані
Наявність даних та матеріалів
Набори даних, використані та/або проаналізовані під час поточного дослідження, доступні у відповідного автора на обґрунтований запит.
Анотація
Вступ
Пошкодження ДНК є важливим етіологічним фактором раку легенів (1), і існують різні типи пошкодження ДНК, включаючи нуклеотидні зміни (делеції, вставки та заміни нуклеотидів), одноланцюгові розриви та дволанцюгові розриви (2). Коли відбувається пошкодження ДНК, активується набір шляхів відновлення ДНК (3–5). Серед цих шляхів основний шлях висічення (BER) відповідає за відновлення більшості пошкоджень ДНК, спричинених алкілуванням та окислювальним стресом (4,6).
Апуринова/апіримідинова (AP) людська ендонуклеаза 1 (APE1), також відома як APE, APEX та Ref-1, є всюдисущим багатофункціональним білком, який пов'язаний з BER та окисно-відновною діяльністю. APE1 - це фермент, що обмежує швидкість у шляху BER (7–9). Коли відбувається пошкодження основи, глікозилази в клітині висікають пошкоджену основу, утворюючи АР або абазисний ділянку. На відміну від інших глікозилаз, APE1 є єдиним ферментом, який може обробляти вушковий вузол BER; APE1 гідролізує фосфодіефірний каркас 5 'до місця АР, створюючи нормальний 3' гідроксильний кінець і глухий 5 'дезоксирибозовий фосфатний кінець. Під час цього процесу APE1 також набирає різні полімерази та лігази для участі у ремонті. APE1 ссавців також впливає на численні фактори транскрипції ДНК, включаючи індукований гіпоксією фактор (HIF) -1α, білок-активатор (AP) -1, ядерний фактор (NF) -κB та p53 (10), і, роблячи це, побічно сприяє відновленню ДНК.
APE1 - єдиний білок, що відновлює ДНК, який має окислювально-відновну активність (8,10) і відповідає за 95% активності клітинної ендонуклеази (7,8). APE1 здатний регулювати відновний стан амінокислотних залишків у ключових місцях факторів транскрипції, і тому бере участь у різних основних клітинних подіях, включаючи проліферацію, диференціацію, апоптоз та трансформацію. Рівні експресії, аберрантна субклітинна локалізація та закономірності посттрансляційної модифікації APE1 пов'язані з хіміо- та радіорезистентністю (11,12) і пов'язані з поганим прогнозом при багатьох видах раку, включаючи недрібноклітинний рак легенів (НМРЛ) (13–22). Аутоантитіло до APE1 у сироватці крові було запропоновано як потенційний пухлинний маркер та провісник відповіді на хіміотерапію у пацієнтів з НМРЛ (23).
Проточна цитометрія та аналіз клітинного циклу
Клітини ресуспендували в RPMI-1640 при щільності 3 × 10 5 клітин/лунка в 6-лункових планшетах (Costar; Corning Incorporated). Вплив препарату проводили після культивування протягом 24 год і при 1% FBS. Клітини H1975 обробляли BFD (0–30 мг/мл) або MBFD (0–15 мг/мл) протягом 24 годин; Клітини H292 обробляли BFD (0–30 мг/мл) або MBFD (0–20 мг/мл) протягом 24 годин при 37 ° C в атмосфері, що містить 5% CO2. Потім клітини збирали, фіксували холодним 75% етанолом і зберігали при −20 ° C протягом ≥24 год. Згодом, після двічі промивання холодним PBS, клітини інкубували з фарбувальним буфером пропидію йодидом (PI)/RNase (BD Biosciences, Сан-Дієго, Каліфорнія, США) протягом 15 хв при кімнатній температурі. Вміст ДНК аналізували за допомогою проточної цитометрії з використанням BD Accuri C6 (версія 1.0.264.15; BD Biosciences). Відсоток клітин у різних фазах клітинного циклу визначали за допомогою програмного забезпечення ModFit LT 4.1 (BD Biosciences).
Аналіз фарбування анексину V/PI
Фарбування анексину V/PI проводили за допомогою набору для виявлення апоптозу (Dojindo Molecular Technologies, Inc., Кумамото, Японія). Після обробки клітини збирали і розчиняли у 100 мкл зв’язуючого буфера Анексину V (5 × 10 5 клітин/мл). До 100 мкл кожної проби додавали 5 мкл додатку V і 5 мкл PI, і зразки інкубували протягом 15 хв при кімнатній температурі. Аналіз апоптозу проводили за допомогою BD Accuri C6. Анексин V-негативні/PI-негативні клітини ідентифіковані як життєздатні клітини, Анексин V-позитивні/PI-негативні клітини визнані ранніми апоптотичними клітинами, а Анексин V-позитивні/PI-позитивні клітини визначені як пізні апоптотичні/мертві.
Аналіз комет
Клітини суспендували в крижаному 1X PBS (без Ca 2+ - та Mg 2+) до концентрації 2 × 10 5 клітин/мл. Розриви ниток ДНК оцінювали за допомогою набору Trevigen CometAssay ® (Trevigen, Gaithersburg, MD, USA). Клітини (2 × 10 5 клітин/мл) змішували з розплавленою LMAgarose при об'ємному співвідношенні 1:10 і суміш відразу рівномірно розподіляли на предметні стекла, які інкубували при 4 ° C у темряві протягом 10 хв. Потім предметні стекла переносили в попередньо охолоджений розчин для лізису протягом 60 хв при 4 ° С.
Для аналізу лужної комети предметне скло інкубували в 300 мМ NaOH, що містить 1 мМ ЕДТА (рН> 13), протягом 20 хв при кімнатній температурі в темряві та електрофорезували при 1 В/см і 300 мА протягом 40 хв. Після тривалого промивання предметні стекла інкубували в 70% етанолі протягом 5 хв і сушили. Нарешті, ДНК фарбували барвником SYBR-Green I (1: 10000 у буфері Tris-EDTA, рН 7,5; Тревіген) протягом 20 хв при 4 ° C. Зображення були зроблені за допомогою флуоресцентного мікроскопа (TCS SP5; Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Німеччина).