Внутрішньоутробне вплив низьких доз DBP у мишей індукує ожиріння у потомства шляхом придушення
Предмети
Анотація
Вступ
Ожиріння - це порушення метаболічного захворювання, що характеризується дисбалансом енергії та надмірним накопиченням жиру. Однак механізми, що спричиняють захворювання, ще не до кінця з’ясовані. Відомо, що генетичні фактори, неправильне харчування та малорухливий спосіб життя є основними причинами ожиріння, але лише 16% людей з ожирінням мають генетичне ожиріння. Одна з гіпотез передбачає, що фактори навколишнього середовища є основною причиною ожиріння, хоча точні фактори навколишнього середовища, що призводять до ожиріння, не з’ясовані. Гіпотеза обезогенів припускає, що хімічні речовини, що руйнують ендокринну систему (EDC), є основною причиною ожиріння 1,2 .
Ефіри фталатів (ПАЕ), які широко використовуються у виробництві пластмас, були залучені до ОДГ, і дослідження показали, що вплив низьких доз ПАЕ може бути пов'язаний із ожирінням. Поперечне дослідження 5149 пацієнтів, проведене Національним обстеженням здоров’я та харчування (NHANES), виявило статистично значущу асоціацію індексу маси тіла (ІМТ) та окружності талії з фталатами 3. У проспективному дослідженні 70-річних дорослих із Університету Уппсали у Швеції було встановлено, що резистентність до інсуліну тісно корелює з впливом метаболітів фталатів 4. Це дослідження показало, що метаболіти фталату можуть впливати на метаболізм глюкози шляхом шляху, що активуються проліфератором пероксисоми (PPAR). Існують також дані, що моно (2-етилгексил) фталат (МЕГП) перешкоджає біологічній трансформації жирової тканини, порушує роботу ендокринної гормональної системи та спричиняє порушення регуляції системи контролю гіпоталамус-гіпофіз – наднирники для сприяння утворенню жиру через різноманітність біологічних шляхів, включаючи втручання в роботу стероїдних або тиреоїдних гормонів та активацію PPAR 5 .
Матеріали і методи
Тварини та лікування
Мишей SPF C57BL/6J у віці 8 тижнів було отримано з лабораторного тваринного центру Університету Цзілінь (Чанчунь, Цзілінь, Китай). Мишей годували стандартним раціоном, що містив (г%): 22,60% білка, 50,87% вуглеводів, 3,37% ліпідів, 3,33% клітковини, 6,88% мінеральних речовин і 12,95% води, і підтримували при 22 ± 1 ° C при 12-годинному освітленні/темний цикл та їжа та вода за бажанням. Експеримент на тваринах проводився відповідно до Керівництва Національного інституту охорони здоров’я щодо догляду та використання лабораторних тварин і був затверджений Комітетом з догляду та використання тварин Університету Бейхуа.
Вимірювання складу тіла
В кінці 21-тижневого випробування склад тіла мишей аналізували точно на загальний жир і нежирну масу тіла за допомогою аналізатора складу тіла дрібних тварин (Minispec LF-50, Bruker, Німеччина).
Тести на толерантність до глюкози та інсуліну
Наприкінці 21 тижня миші голодували протягом 18 годин для тесту на толерантність до глюкози або 6 годин для тесту на толерантність до інсуліну. Кров забирали з хвостової вени та вимірювали рівень глюкози в крові натще (час 0) за допомогою ультраглюкометрів One-Touch (Life Scan). Потім тваринам вводили або 2 г/кг глюкози, або 0,75 ОД/кг інсуліну (Regular Humulin, Eli Lilly та Company) шляхом внутрішньочеревної ін’єкції. Криві рівня глюкози в крові були намальовані на основі глюкози у зразках крові, відібраних через 15 хв, 30 хв, 60 хв і 120 хв після ін’єкції, і розрахована площа під кривою (AUC).
Дослідження метаболічних клітин
Окремих тварин утримували в клітках з 12-годинним циклом темряви/світла при кімнатній температурі (22 ± 1 ° C). Базальне споживання їжі та води, елімінація сечі та калу, споживання кисню (VO2), вироблення вуглекислого газу (VCO2) та рухова активність визначалися в цей період калориметричною системою TSA (Система TSA, Німеччина) та витратами енергії (EE ) та коефіцієнт дихання (RQ) були розраховані за допомогою цих параметрів. Температуру вимірювали в задньому проході.
Хімічна сироватка та печінка
Зразки крові центрифугували при 3000 об/хв протягом 10 хв для отримання сироватки, а тканини печінки гомогенізували. Інсулін сироватки натще і лептин сироватки натще вимірювали за допомогою наборів ELISA від Dingguo Changsheng Biotechnology (Пекін, Китай). Рівні TG, TC, вільних жирних кислот (FFA), печінкових TG та печінкових TC визначали за допомогою відповідних аналізів (Інститут біоінженерії Нанкін Цзяньчен, Нанкін, Цзянсу, Китай).
Гістологічний аналіз
Тканини фіксували у 4% параформальдегіді (рН 7,4) протягом 24 годин при кімнатній температурі, вкладали у парафін та розрізали на зрізи товщиною п’ять мікрометрів. Зрізи ВАТ і підшлункової залози фарбували гематоксиліном та еозином (Dingguo Changsheng Biotechnology, Пекін, Китай), а зрізи печінки - олійним червоним O (Wuhan Goodbio technology Co., Ltd., Wuhan, China). Зображення були зроблені за допомогою цифрової камери (DP20, Olympus, Токіо, Японія) для оцінки гістопатології тканин.
ПЛР у реальному часі для вимірювання експресії
Загальну мРНК коричневої жирової тканини (BAT) виділяли за допомогою RNAiso plus (TaKaRa Dalian Biotechnology, Далянь, Китай). Зворотну транскрипцію проводили за допомогою реагентного комплекту Prime Script RT (TaKaRa Dalian Biotechnology, Далянь, Китай). Кількісна ПЛР у режимі реального часу з використанням SYBR Premix Ex Taq Mix (TaKaRa Dalian Biotechnology, Далянь, Китай) проводилася в системі ПЛР ABI Q6 у реальному часі (ABI, Карлсбад, Каліфорнія, США). Загальний об'єм реакції становив 7 мкл, включаючи 0,25 мкл кожного праймера (10 мкМ), 2 мкл десятикратно розведеної кДНК, 3,5 мкл SYBR Premix Ex Taq і 1 мкл H2O без РНКази. Конкретні умови реакції становили: 2 хв при 95 ° C, після чого 40 циклів по 15 с при 95 ° C і 1 хв при 60 ° C. Результати нормалізували до рівня β-актину (метод 2 -ΔΔCt). Використовувані праймери були отримані від Sangon Biotech (Шанхай, Китай) і перераховані в Таблиці 1.
Вестерн-блот-аналіз
BAT відокремлювали, заморожували в рідкому азоті і зберігали при - 80 ° C до використання. Для вестерн-блот-аналізу зразки гомогенізували в буфері RIPA, що містить 0,1% PMSF (KeyGEN BioTECH, Нанкін, Китай), центрифугували (12000 ×g, 15 хв, 4 ° C), і супернатант збирали. Вміст білка визначали за допомогою набору BCA (Thermo Fisher Scientific, Сан-Хосе, Каліфорнія, США). Рівні кількості білка (60 мкг/смуга) розділяли на 8% гелях SDS-PAGE і потім переносили на мембрани PVDF. Після блокування 5% знежиреного молока протягом 2 год при кімнатній температурі мембрани інкубували з такими первинними антитілами: β-актин (1: 500, Санта-Крус, Каліфорнія, США); Роз’єднання білка 1 (UCP1) (1: 1000, Санта-Крус); Зв'язуючий білок імуноглобуліну (Bip) (1: 1000, Санта-Крус); Гомологічний білок CCAAT/енхансер-зв’язуючий білок (Chop) (1: 1000, Санта-Крус) у TBS-T, що містить 3% BSA протягом ночі при 4 ° C. Потім мембрани інкубували з кон'югованим HRP вторинним антитілом (розведення 1: 5000, біотехнологія Dingguo Changsheng, Пекін, Китай) при 37 ° C протягом 2 годин. Після трьох промивань у TBS-T зображення виявляли за допомогою хемілюмінесцентної системи виявлення (Tanon Image System Ver.5200, Шанхай, Китай).