Вплив бісфенолу А під час вагітності на ранніх термінах погіршує реконструкцію спіральної матки та провокує
Предмети
Анотація
Вступ
Живі організми щодня піддаються дії ендокринних руйнуючих хімічних речовин (ЕДК), які є екзогенними, переважно штучними речовинами, які виявляють гормональну активність. Отже, вони здатні втручатися, здебільшого негативно, у нормальні ендокринні шляхи, і тому їх називають екологічними естрогенами або ксеноестрогенами. EDC, зокрема, перешкоджають процесам, що регулюються ендогенними естрогенами; EDC можуть негативно впливати на естроген-опосередковані репродуктивні процеси 1 .
Матеріали і методи
Тварини
Самки мишей C57BL/6 та самці мишей BALB/c були придбані у лабораторії Janvier (Франція) та надійшли до нашого тваринницького закладу у віці від 8 до 11 тижнів. Самки утримувались групами по 2–4 тварини в клітці. Миші отримували воду і їжу ad libitum і розміщувались із 12-годинним циклом світло/темрява (7:00 - 19:00) при 22 ± 2 ° C та вологості повітря 40–60%. Експерименти розпочали через 2 тижні акліматизації.
Експериментальне проектування та збір зразків
Експерименти на тваринах проводились згідно з інституційними рекомендаціями після затвердження міністром (Landesverwaltungsamt Sachsen Anhalt: 42502-2-1296UniMD, Магдебург, Німеччина). Експерименти проводились уповноваженими особами згідно з Керівництвом по догляду та використанню тварин у сільському господарстві, дослідженні та навчанні. Самки мишей C57BL/6 були спаровані з самцями BALB/c, щоб отримати алогенне спаровування, яке відображає ситуацію ссавців у природі, включаючи людей. День пробки визначали як день гестації (gd) 0. Самкам gd1 давали щодня 50 мкг/кг BPA/день, розведеного в 0,1% етанолі протягом 7 днів пероральним введенням. Контрольні миші отримували 0,1% етанолу, використовуючи ту ж процедуру. Кількість та розмір імплантації контролювали протягом всієї вагітності за допомогою високочастотного УЗД. Вагітних самок приносили в жертву на gd5, gd10 або gd14. Кількість імплантацій реєстрували для тварин, принесених в жертву на gd5. Для тих тварин, яких приносили в жертву gd10 та gd14, реєстрували імплантацію та аборти, а також вагу плодів та плаценти. Вагітну матку розсікали, і одну імплантацію кожній самці при gd10 розтинали і фіксували в 4% розчині параформальдегіду (PFA), що містить сахарозу.
Високочастотне ультразвукове дослідження
Для того, щоб проаналізувати внутрішньоутробний розвиток ембріона та плода, ультразвукові дослідження проводили на gd5, 8, 10, 12 та 14 із використанням системи Vevo 2100 (Fiji Fil Visualsonics Inc). Мишей знеболювали за допомогою ізофлурану в герметичній коробці. Втративши свідомість, миші були зафіксовані в спинному положенні. Ми використовували крем для депіляції для видалення шлунка з черевної порожнини. Залежно від gd, розміру імплантації (gd5, 8, 10, 12), площі плаценти, -товщини та -діаметра (gd10, 14) або кровотоку в артерія матки (маточна артерія) (UA, gd5, 8, 10, 12, 14) реєстрували. Були визначені пікова систолічна швидкість (PSV) та кінцева діастолічна швидкість (EDV). Крім того, вимірювали індекс опору (RI) та індекс пульсації (PI). Аналіз записаних параметрів проводився за допомогою програмного забезпечення Vevo 2100.
Вимірювання маси плода та плаценти
Для документування ваги плаценти та плода при gd14 збирали і розкривали вздовж дворогу матку кожної миші. Плоди та плацента були відокремлені від навколишньої децидуальної тканини та жовткового мішка. Потім можна визначити вагу кожного плоду та кожної відповідної плаценти за допомогою шкали (Kern & Sohn GmbH, мінімум: 0,02 г, чутливість: 0,001 г). Обмеження росту плода визначали як вагу нижче 10-го процентилю у порівнянні з вагами, зареєстрованими для тварин контрольної групи 38 .
Гістологія
Імплантації фіксували в 4% PFA, що містив 0,1 М сахарози (рН 7,4), протягом 6 годин, обережно струшуючи при кімнатній температурі (RT). Перед нічним зберіганням при 4 ° C їх переносили в 70% етанол. Наступного дня зразок для імплантації зневоднювали висхідним етаноловим рядом та інкубували в ксилолі перед вкладанням парафіну. Вирізали 5 мкм предметних стекол для подальшого фарбування гематоксиліном та еозином (H/E; для аналізу спіральних артерій), імунофлуоресцентного фарбування актину гладких м’язів (SMA; для аналізу спіральних артерій) або фарбування лектину Dolichus Biflorus Agglutinin (DBA) для виявлення матки Аналіз природних клітин-кілерів (uNK)). Для аналізу присутності uMCs фарбування толуїдиновим синім проводили наступним чином: вагітні матки при gd5 інкубували в 96% етанолі. Для зневоднення зразки витримували у 100% етанолі протягом двох годин, перед тим як переносити їх у ксилол ще протягом 2 годин та подальшого вкладання парафіну. Фарбування H/E, IF, DBA лектином та синім толуїдином проводили, як описано раніше 39 .
Аналіз спіральних маткових артерій (США)
Параметри, що визначають ремоделювання uSA, аналізували на зафарбованих H/E слайдах імплантацій, вбудованих у парафін, отриманих при gd10. Детальніше про те, як було отримано зразки для локалізації SA, див. 40. За допомогою світлового мікроскопа Zeiss було виявлено та проаналізовано 3–8 uSA decidua basalis однієї імплантації на мишу. За допомогою функції меню «Kontur (сплайн)» AxioVision Rel. За програмою 4.8, зовнішнє та просвіт 3–8 артерій на тварину вимірювали у 20-кратному збільшенні. Отримані значення використовувались для розрахунку діаметра (діаметр = окружність/π), відношення стінки до просвіту (діаметр uSA/діаметр просвіту), а також товщини стінки (діаметр uSA - діаметр просвіту)/2). Середні значення параметрів, згаданих вище, розраховували для кожної тварини.
Кількісна оцінка uMC та uNK
Кількісний коефіцієнт uMC визначали при gd5 у зрізах толуїдинового синього кольору матки, тоді як uNK визначали кількісно у зразках імплантації, забарвлених DBA-лектином, за допомогою мікрометрового окуляра, який вставляли у світловий мікроскоп. Мікрометровий окуляр був розміщений у десяти різних місцях у пофарбованому зразку. Поодинокі квадрати 10 × 10 представляють 60 × 60 мкм у збільшенні 20 ×, таким чином можна дослідити площу 0,36 мм². Після розрахунку середнього значення 10 одинарних квадратів та врахування виміряної площі було визначено кількість uMC/uNK на 1 мм². Фарбування DBA лектином та толуїдиновим синім проводили, як описано раніше 39 .
Статистика
Розподіл наборів даних (нормальний чи ненормальний) оцінювали за допомогою тесту D’Agostino Pearson-Omnibus перед аналізом даних за допомогою параметричних або непараметричних тестів. Залежно від їх розподілу дані подаються як середні значення ± ЕЕМ або медіани. Кількість проведених мишей, зразків або експериментів, а також використовуваний статистичний тест та відповідні дані значення вказані у відповідних легендах рисунків. GraphPad Prism 5.0 використовували для проведення статистичного аналізу. Перед аналізом даних ми проконсультувались із Статистичним відділом нашого факультету (Institut für Biometrie und Informatik, Medizinische Fakultät, OVGU, Магдебург) щодо відповідного тесту для кожного експерименту.