Вплив дієтичних добавок Bacillus subtilis B10 на біохімічні та молекулярні параметри

Анотація

10 枯草芽孢杆菌 B10 对高脂日粮诱导的小鼠脂肪代谢及氧化应激的改善作用, 并初步探讨其作用机制。

证明了枯草芽孢杆菌 B10 可以有效改善高脂日粮诱导的小鼠脂肪代谢和氧化应激, 且发现此作用主要与 B10 调节脂肪代谢基因 (PPARα 、DHCR24、HMGCS2) 及氧化应激基因 (XO、с53) 表达和谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px) 活力有关。

将 ICR 雄鼠分为对照组 (饲喂高脂日粮) 和实验组 (饲喂添加枯草芽孢杆菌菌粉的高脂日粮)。饲喂 30 天后, 收集小鼠的血清及肝脏样品。采用试剂盒测定抗氧化及脂肪代谢相关指标和肝脏中 8- 羟基脱氧鸟苷 (8-OHdG) 含量。使用荧光定量聚合酶链式反应 (PCR) 测定小鼠肝脏中脂肪代谢和氧化应激相关基因的表达水平。

饲喂含有枯草芽孢杆菌 B10 的高脂日粮能够有效降低小鼠的体重 (表 2), 降低血清中葡萄糖和甘油三酯含量及谷草转氨酶和谷丙转氨酶活力 (表 3 和 4);下调肝脏中脂肪合成相关基因表达量, 但上调脂肪分解相关基因表达量 (图 1), 并提高肝脏中抗氧化相关基因表达量 (图 2)。综上所述, 枯草芽孢杆菌 B10 能有效调节小鼠脂肪代谢, 并改善其氧化应激。

1. Вступ

Для профілактики ожиріння було використано кілька стратегій, включаючи контроль дієти, фізичні вправи, поведінкову терапію та ліки. Пробіотики, які визначаються як «живі мікроорганізми, які при введенні в достатній кількості приносять користь для здоров’я господареві» (Арая та ін., 2002), може модулювати кишкову флору і мати деякі антиоксидантні та ліпідзнижуючі здібності (Endo та ін., 2013; Еверард та ін., 2014). Bacillus subtilis є кишковим мікроорганізмом, який може рости в кишечнику та споживати кисень для підтримки анаеробного середовища для профілактики або терапії шлунково-кишкових розладів (Ху та ін., 2014). На додачу, Bacillus subtilis є кращим через його вищу стійкість до суворих середовищ та здатність до тривалого зберігання при температурі навколишнього середовища (Hong та ін., 2005). Раніше ми повідомляли, що Bacillus subtilis B10 мав позитивний ефект на антиокислювальний захист клітин в пробірці (Лі та ін., 2013), і ці результати приводять нас до подальшого дослідження регуляторного впливу Bacillus subtilis B10 щодо антиоксидантної та гіполіпідемічної здатності індукованих HFD мишей із ожирінням.

2 Матеріали та методи

2.1 Штам бактерій

Bacillus subtilis Порошок В10 (10 8 колонієутворюючих одиниць (КУО)/г) був приготований Лабораторією мікробіології та генної інженерії Інституту кормових наук Університету Чжецзян, Китай. Штам В10 культивували на середовищі Лурія-Бертані, витримували при 37 ° С протягом 24 год і струшували при 180 об/хв. Чисті бактеріальні клітини збирали після центрифугування при 5000g протягом 10 хв при 4 ° C та охолодженні. Після цього ці клітини двічі промивали стерильним 0,85% (8,5 г/л) розчином хлориду натрію. Врешті-решт, чистоту та ідентифікацію культури постійно перевіряли методом розкидання пластин (Nikoskelainen та ін., 2003).

2.2 Тварини та дієти

Тридцять мишей ICR (7–8 тижнів), = 15 на групу) були отримані від Інституційного комітету з догляду та використання тварин Університету Чжецзян, Китай. Усі миші були розміщені в стандартних пластикових клітках (по три миші в клітці) і підтримувались протягом 12-годинного циклу світло-темрява при постійній температурі та вологості ((23 ± 1) ° C та (55 ± 5)% відповідно). Одну групу мишей годували HFD (92,8% нормальної дієти, 2% холестерину, 5% сала та 0,2% холату), а іншу тримали на HFD з додаванням 0,1% (мас./Мас.) Порошку B10 протягом 30 днів . Звичайний раціон харчування забезпечувався Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd. (Шанхай, Китай), а рівень поживних компонентів зазначений у додатковому матеріалі, таблиці S1. Під час приготування порошку В10 для розведення В10 використовували крохмаль, а таку ж кількість крохмалю також додавали до групи HFD для компенсації різниці у складі поживних речовин дієт. Всіх мишей годували ad libitum і зафіксовано споживання їжі. Експеримент було схвалено та проведено відповідно до рекомендацій місцевого комітету з етики.

2.3 Збір зразків

Через 30 днів миші (= 6) від кожної групи (HFD і B10) голодували протягом 12 год, а потім знеболювали діетиловим ефіром. Мишей вбивали при вивиху шийки матки, а проби крові відбирали з нижньої порожнистої вени. Після інкубації при 4 ° С протягом 30 хв і центрифугування при 2000 рg протягом 20 хв отримували сироватку (Центрифуга 5804R, Еппендорф, Німеччина). Зразки печінки розтинали і поміщали в рідкий азот. Зразки остаточно заморожували і витримували при -80 ° C не більше 2 місяців до подальшого аналізу.

2.4 Біохімічні дослідження сироватки

Вміст глюкози, тригліцеридів (TG), загального холестерину (TC), холестерину ліпопротеїдів низької щільності (LDL-C), холестерину ліпопротеїдів високої щільності (HDL-C), азоту сечовини крові (BUN), глутамінової оксалооцтової трансамінази (GOT ), а глутамінової піровиноградної трансамінази (GPT) у сироватці крові визначали спектрофотометрією згідно з інструкціями виробника набору. Методи цих наборів представлені у додатковому матеріалі Дані S1. Матеріали для вимірювання глюкози були придбані у компанії Rongsheng Bio-Pharmaceutical Co., Ltd., Шанхай, Китай. Набори для сироватки TG і TC були придбані у Saike Bio-technology Co., Ltd., Нінбо, Китай. Набори для сироватки BUN, GOT та GPT були придбані в Інституті біоінженерії Нанкін Цзяньчен, Нанкін, Китай. Матеріали для сироватки LDL-C та HDL-C були придбані у клінічного реагенту Beihuakangtai Co., Пекін, Китай.

2.5 Біохімічні аналізи печінки

Зразки печінки гомогенізували крижаним фізіологічним розчином (1:10, об./Об.) І центрифугували при 2000 р.g протягом 10 хв (Центрифуга 5804R, Еппендорф, Німеччина). Супернатант збирали для визначення загальної антиоксидантної здатності (T-AOC), антисупероксидної аніонної активності (ASOA), концентрацій TC, TG, LDL-C, HDL-C, 8-гідрокси-2'-дезоксигуанозину ( 8OHdG), глутатіон (GSH) та тіоредоксинредуктаза (TrxR), а також активність супероксиддисмутази (SOD), каталази (CAT), глутатіонпероксидази (GSH-Px) та ксантиноксидази (XO). Набори для печінкових ТК та ТГ були отримані від Saike Biological Technology Co., Ltd., Нінбо, Китай. Набори для печінкового LDL-C та HDL-C були придбані у клінічного реагенту Beihuakangtai Co., Пекін, Китай. Набори для SOD, CAT, GSH-Px, XO, T-AOC, ASOA та GSH були придбані в Інституті біоінженерії Нанкін Цзяньчен, Нанкін, Китай. Усі вищезазначені параметри визначали спектрофотометрією відповідно до інструкцій виробника. Набори для імуноферментного аналізу (ELISA) для 8-OHdG та TrxR були придбані у Bioleaf Biological Co., Ltd., Шанхай, Китай.