Вплив гіперфібриногенемії на судинну систему мишей C57BL6 з атерогенною дієтою та без неї

З навчальної програми з генетики та молекулярної біології (A.A.G., S.T.L.), кафедра біостатистики (C.M., T.S., G.K.) та кафедра патології та лабораторної медицини (S.T.L.), Університет Північної Кароліни, Чапел-Хілл.

Ви переглядаєте останню версію цієї статті. Попередні версії:

Анотація

Завдання— Підвищений рівень фібриногену корелює з важким атеросклерозом, що визначається появою ішемічних подій, проте механістична основа цієї кореляції залишається невідомою. Для вивчення цього взаємозв'язку ми дослідили спонтанний та індукований дієтою атеросклероз у трансгенних мишей з гіперфібриногенемією (підвищений фібриноген).

Методи та результати - Звичайних і трансгенних мишей годували або атерогенною дієтою, або простою селекційною чау. Ми виміряли рівень фібриногену в плазмі крові та виявили вікове та залежне від дієти збільшення фібриногену. Через 8-12 місяців проводили підготовку та фарбування зрізів аорти, а також підраховували, вимірювали та оцінювали зрілість уражень, що містять ліпіди. Заповнені ліпідами відкладення спонтанно з’явились у невеликої кількості мишей на селекційній чау; типові ураження жирового прожилка з'явилися майже у всіх тварин, що харчуються дієтою. Морфометричний аналіз показав, що ні на кількість, ні на розмір уражень не впливали ні рівень фібриногену, ні генотип.

Висновки - Наші дані показали, що ні концентрація фібриногену, ні генотип не мали статистично значущого впливу на ініціювання, початковий ріст або раннє прогресування атеросклеротичних уражень.

Добре відомо, що підвищений рівень фібриногену корелює з важким атеросклерозом, що визначається появою ішемічних подій. Першим великим дослідженням, яке повідомило про цю кореляцію, було дослідження серця Нортвік-Парку, в якому в 1980 р. Meade та співавт. 1 продемонстрували значну зв'язок між серцево-судинною смертю та концентрацією фібриногену, яка не залежала від інших факторів ризику. З тих пір багато звітів пов’язують підвищений рівень фібриногену з усіма формами серцево-судинних захворювань (ССЗ). Дослідження Caerphilly/Speedwell показали, що підвищений рівень фібриногену корелює з ішемічною хворобою серця. 2 Дослідження в Гетеборзі повідомляло, що фібриноген асоціюється з інфарктом міокарда та інсультом, ішемічною хворобою серця та загальною смертністю. 3 Фрамінгемське дослідження показало, що різні ССЗ мають кореляцію з фібриногеном, включаючи інсульт, ішемічну хворобу та оклюзійну хворобу периферичних артерій. 4,5 Оскільки численні дослідження підтвердили ці висновки (див. Огляд 6), немає сумнівів у тому, що підвищений фібриноген у плазмі корелює із ССЗ.

Патологічний механізм, який пов'язує гіперфібриногенемію з підвищеним ризиком клінічно очевидного атеросклерозу, залишається невідомим. Однією з гіпотез є припущення про вплив фібриногену на гладком’язові клітини (СМК) та ендотеліальні клітини, в яких фібриноген діє як попередня матриця для міграції, а продукти розпаду фібрину (огену) діють як мітогени. 7 Ці механізми дозволяють припустити, що підвищений фібриноген сильно впливає на 2 клітини, які беруть участь у формуванні уражень. І навпаки, підвищений рівень фібриногену може бути наслідком атеросклерозу, оскільки фібриноген є білком гострої фази, і його рівень зростає у відповідь на захворювання. Звичайно, підвищений рівень фібриногену може бути як причиною, так і наслідком атеросклеротичної хвороби.

Щоб забезпечити експериментальну систему для вивчення механістичних основ зв'язку між підвищеним фібриногеном та ССЗ, ми генерували трансгенних мишей з гіперфібриногенемією. У цьому дослідженні ми використовували їх для визначення того, чи підвищений рівень фібриногену впливає на атеросклероз, викликаний дієтою у мишей. Ми обрали дієтичну модель для вивчення ініціації та раннього розвитку атеросклерозу, оскільки ми передбачали, що підвищений рівень фібриногену сприятиме патогенезу захворювання. Хоча індуковані дієтою ураження не прогресують до пізніх стадійних бляшок, ураження жировими прожилками в проксимальній аорті нормальних мишей подібні до дуже ранніх уражень у людей. 8 Ураження на нашій миші були досліджені на предмет зміни ініціації, обтяження та зрілості, які зумовлені рівнем генотипу або фібриногену.

Методи

Матеріали

Хімічні речовини купували у Sigma Chemical Co, якщо не зазначено інше. Анестезуючі препарати були придбані у компанії Barber Veterinary Supply. Кролячі антитіла до людського фібриногену були від Dako Corp. Матеріали для забору крові, зрізу та фарбування були від Fisher. Заводчик чау був Picolab Mouse Diet 20 (№ 5058 опромінений) від Purina-Mills; атерогенна дієта (TD 88051) була від Харлан/Теклад.

Трансгенні тварини

Усі процедури за участю мишей були схвалені Інституційним комітетом з догляду та використання тварин. Мишей утримували в повнобар'єрному приміщенні в стерилізованих клітках. Як описано раніше, ми генерували трансгенних мишей шляхом мікроін'єкції локусу фібриногену миші в ооцити C57BL/6. 9 Трансген являв собою фаговий клон Р1 з 80-кілобайтною вставкою 129 геномних ДНК SvEv, включаючи 50-кілобазний фібриногенний локус (α, β та γ), фланкирований на 5 і 25 кб. Трансгенних мишей ідентифікували за допомогою полімеразної ланцюгової реакції. Ми встановили позитивну лінію трансгенного фібриногену (FT +), у якій концентрація фібриногену в плазмі майже вдвічі перевищувала концентрацію нормальних мишей C57BL/6. У цих тварин відсутні дефекти родючості і тромботичні захворювання, і вони живуть нормально. 9

Експериментальний дизайн

Мишей до нашої ери годували заводчиком чау до евтаназії через 8 місяців (миші BC8) або 12 місяців (миші BC12); чау-селекціонер містив стандартні поживні речовини плюс 9% жиру і 20% білка. Мишей AD годували селекційним чау протягом 4 місяців, а потім годували атерогенною дієтою до евтаназії через 4 місяці (миші AD4, вік 8 місяців) або 6 місяців (миші AD6, вік 10 місяців) на дієті; ця атерогенна дієта, розроблена Пейгеном та співавт., 8 містила стандартні поживні речовини плюс 15,8% жиру, 1,25% холестерину та 0,5% холату натрію. Кров відбирали у всіх тварин щомісяця, починаючи з 2 місяців (миші до нашої ери) або через 4 місяці (у мишей з AD, за 1 день до початку атерогенної дієти).

Плазмові аналізи

Тварин голодували протягом 4-6 годин і знеболювали кетаміном/ксилазином (0,31 мл/0,11 мл, доведені до 1 мл у стерильному фізіологічному розчині), виходячи з ваги (0,1 мл/30 г). Кров брали з ретро-орбітального простору і центрифугували при 15000 об/хв протягом 15 хвилин, а супернатант плазми зберігали при -80 ° C. Рівні фібриногену визначали методом ІФА. 9 Загальний холестерин визначали за допомогою модифікації набору загального холестерину Wako CII. Коротко кажучи, у 96-лунковому планшеті 100 мкл хромогенного розчину субстрату/ферменту змішували з 1 мкл зразка (у двох примірниках). Через 10 хвилин при 37 ° C планшет зчитували при 550 нм. Загальний холестерин у міліграмах на децилітр визначали як середню оптичну щільність зразка, поділену на середню оптичну щільність стандарту.