Вплив поверхнево-активної речовини та гіпертермостабільної протеази на інфекційність мишей, інфікованих скрейпі
1 Вища школа наук про життя та навколишнє середовище, Префектурний університет Кіото, 1-5 Хангі-чо, Шімогамо, Сакьо-ку, Японія
2 кафедри анатомії та клітинної біології, медичний факультет, медичний коледж Осаки, 2-7 Дайгаку-мачі, Такацукі, Японія
3 Лабораторія біометаболічної хімії, Школа наук про здоров'я, Медичний факультет, Університет Рюкюса, 207 Уехара, Нісіхара, Японія
4 Кафедра матеріалознавства та науки про життя Вищої інженерної школи, Університет Осаки, 2-1 Ямадаока, Суїта, Японія
Автор-кореспондент: Юїчі Кога
Кафедра матеріалознавства
Вища інженерна школа Університету Осаки
2-1 Ямадаока, Суїта, Осака 565-0871, Японія
Тел .: +81-6-6879-7443
Факс: +81-6-6879-7443
Електронна пошта: [електронна пошта захищена]
Дата отримання: 22 липня 2015 р .; Дата прийняття: 25 серпня 2015 р .; Дата публікації: 31 серпня 2015 року
Цитування: Hirata A, Sakudo A, Takano K, Kanaya S, Koga Y (2015) Вплив поверхнево-активної речовини та гіпертермостабільної протеази на інфекційність гомогенату мозку миші, інфікованого скрейпі. J Biotechnol Biomater 5: 194. doi: 10.4172/2155-952X.1000194
Відвідайте для отримання додаткових статей за адресою Журнал біотехнологій та біоматеріалів
Анотація
Вважається, що PrP Sc є інфекційним агентом TSE, і інактивувати інфекційність PrPSc без використання сильних реагентів важко. Хоча PrPSc є протеазостійким білком, він може розщеплюватися in vitro за допомогою гіпертермофільної протеази (Tk-субтилізин) при температурах вище 65 ° C завдяки синергетичному ефекту дестабілізації тепла PrP і високій протеолітичній активності термостабільної протеази. Однак зміна інфекційності засвоєного протеазом PrPSc досі невідоме. Тому ми використовували гомогенат мозку миші, що містить PrPSc (SBH), у біологічному дослідженні для дослідження втрати інфекційності після перетравлення Tk-субтилізину. Дивно, але засвоєний Tk-субтилізином SBH зберігав високий рівень зараженості. Незважаючи на це, Tk-субтилізин все ще може використовуватися для знезараження в умовах денатурації з високим вмістом білка, наприклад, у присутності SDS.
Ключові слова
Протеаза; Термостабільний фермент; Пріон; Скрепі; Тксубтілізин
Скорочення
PrP: білок Prion; PrP Sc: PrP, пов’язаний зі скрепі; PrP C: стільниковий PrP; ТСЕ: Трансмісивна спонгіформна енцефалопатія; CJD: хвороба Кройцфельда - Якоба; SBH: Мишачий скрепі (гострий мозок); ПК: протеїназа К; SDS: Додецилсульфат натрію; GdnHCl: гідрохлорид гуанідину; DTT: дитиотреїтол; SDW: Стерилізована дистильована вода
Вступ
Аномальний пріонний білок з конфірмацією, багатою на β-лист, позначений прионовим білком, пов'язаним зі скрейпі (PrP Sc) [1], є основним білковим компонентом інфекційного пріона, пов'язаного з трансмісивними губчастими енцефалопатіями (ТСЕ) [2]. PrP відрізняється від PrPC та PrP Sc за своєю інфекційністю, і вони мають різні фізичні властивості, такі як чутливість до протеїнази К та розчинність. PrP Sc частково стійкий до перетравлення протеїнази К і сприяє утворенню різних олігомерів [1,3]. PrP Sc утворюється з PrPC через його структурні зміни від α-багатої конформації до β-багатої конформації [4]. PrP Sc індукує структурні зміни PrPC, зв'язуючись і будучи матрицею нової молекули PrP Sc. Таким чином, PrP Sc - це білкова, що саморозмножується молекула [5-7].
Оскільки PrP Sc стійкий до денатурації теплом при 121 ° C та багатьох хімічних методів дезактивації, інактивація PrP Sc є важливою метою дослідження з метою запобігання ТСЕ. Всесвітня організація охорони здоров’я рекомендує поєднувати очищення, хімічну обробку та теплову стерилізацію медичного обладнання [8]. Більш конкретно, рекомендації рекомендують використовувати автоклав та сильні хімічні засоби, такі як гідроксид натрію високої концентрації або гіпохлорит натрію, для інструментів, що використовуються повторно. Хоча ці процедури ефективні для усунення інфекційності, деякі хірургічні та складні інструменти, такі як волоконно-оптичні ендоскопи, не можуть бути знезаражені за допомогою цих методів, оскільки вони можуть бути пошкоджені [9]. Крім того, ризики безпеки, пов'язані із вживанням сильних хімічних речовин, викликають занепокоєння у медичної спільноти [10]. Тому необхідні процедури дезінфекції пріонами з достатньою потужністю та покращеною безпекою [11].
Матеріали і методи
Отримання протеаз
Протеїназа K (PK) була придбана у компанії Wako Pure Chemicals Ltd, Осака, Японія. Tk-субтилізин отримували з рекомбінантної E. coli BL21 (DE3), що містить вектор експресії гена Tk-субтилізину, як описано раніше [14,17].
Приготування гомогенату мозку миші та вестерн-блот
Гомогенат мозку невиліковно хворих мишей, інфікованих штамом Чендлера прионом скрейпі (SBH), готували при 10% (мас./Об.) У стерильному PBS. Концентрацію білка в гомогенаті вимірювали за допомогою набору для аналізу білка постійного струму (BioRad). Для підготовки зразка до деградації PrP відповідну кількість гомогенату, еквівалентну 60 мкг білка, змішували з 0,5 M трис-HCl (рН 8,0) та необхідними концентраціями Tk-субтилізину та дистильованою водою, щоб загальна сума об'єм становив 50 мкл для кожного стану. За необхідності додавали додецилсульфат натрію (SDS) при 3% (мас./Об.). Отримані зразки інкубували при 100 ° C протягом зазначеного часу. Коли потрібна була інактивація Tk-субтилізину, перед підготовкою зразка для електрофорезу в поліакриламідному гелі SDS (SDS-PAGE) додавали 50 мМ диізопропілфторфосфату. Двократний завантажувальний буфер (150 мМ трис-HCl (pH 6,8), 6% (мас./Об.) SDS, 30% (мас./Об.) Гліцерину і 0,03% (мас./Об.) Бромофенолового синього) додавали і зразки варили протягом 5 хв. SDS-PAGE проводили з використанням 15% поліакриламідного гелю, і PrP виявляли вестерн-блот-антигеном анти-PrP-антитілом, SAF83 (SPI bio, Montigny le Bretonneux, Франція).