Знижене M1-подібне M2-подібне співвідношення макрофагів у здоровому розширенні жирової тканини під час SGLT2
Предмети
Анотація
Вступ
Ожиріння стало однією з головних проблем охорони здоров'я останніх десятиліть, будучи ключовим фактором ризику діабету 2 типу, серцево-судинних захворювань, дисліпідемії, гіпертонії та деяких видів раку, що призвело до збільшення смертності. У той час як лікування ожиріння та профілактика захворювань, пов’язаних із ожирінням, не завжди є успішними, підгрупа осіб із ожирінням має низький ризик метаболічних ускладнень. «Метаболічно здорове ожиріння» (MHO) представляє таку підгрупу осіб із ожирінням, які виявляють надмірне накопичення жирової тканини без несприятливих метаболічних ефектів, включаючи резистентність до інсуліну, непереносимість глюкози та дисліпідемію 1. Особи MHO характеризуються підвищеною здатністю до накопичення жиру жирової тканини з протизапальним фенотипом та зменшенням відкладення ектопічного жиру в печінці та скелетних м’язах; ці морфологічні та функціональні зміни в жировій тканині, отже, пригнічують розвиток інсулінорезистентності та кардіометаболічних захворювань.
Інгібітори натрію-глюкози котранспортер 2 (SGLT2) є пероральними протидіабетичними препаратами, які сприяють виведенню глюкози з сечею, блокуючи її реабсорбцію в проксимальних канальцях нирок. Раніше ми повідомляли, що інгібітор SGLT2 іпрагліфлозин (Ipra) сприяє розширенню епідидимальної жирової тканини (Epi) без погіршення системного метаболізму глюкози/ліпідів та жирового запалення у мишей із ожирінням 2,3. Цей стан підвищеної жирової маси зі збереженою метаболічною придатністю називають «здоровим розширенням жирової тканини», що схоже на жирову тканину, виявлену у осіб, що страждають на МГО.
У цьому дослідженні ми продемонстрували, що Іпра сприяла розширенню здорової жирової тканини, пов’язаному зі зниженим співвідношенням М1-подібних/М2-подібних банкоматів. Наше спостереження передбачало, що зміна M1-подібного/M2-подібного співвідношення банкоматів може призвести до того, що адипоцити індукують здорове розширення жирової тканини під час гальмування SGLT2, а ширше - це може запропонувати нові уявлення про механізми розширення жирової тканини, які можуть бути терапевтичними цілями. при пов'язаних із ожирінням супутніх метаболічних захворюваннях.
Матеріали і методи
Експерименти на тваринах
Метаболічний аналіз
Рівні глюкози в крові вимірювали за допомогою глюкометра (Glutest Pro R). Концентрацію інсуліну та вільних жирних кислот у сироватці крові вимірювали за допомогою імуноферментного аналізу (Morinaga, Йокогама, Японія) та ферментативного методу (Wako, Osaka, Japan), відповідно. Рівні бета-гідроксибутирату (BHB) визначали за допомогою колориметричного методу (ab83390, Abcam). Концентрації загального холестерину, тригліцеридів (TG) та аланінамінотрансферази (ALT) у сироватці крові вимірювали за допомогою Fuji Dry-chem 7000 V (Fujifilm Corporation, Токіо, Японія). Для тестів на толерантність до глюкози (GTT) мишей голодували протягом 16 годин із вільним доступом до води з подальшим внутрішньочеревним введенням глюкози (2 г/кг). Ми вимірювали концентрації глюкози в крові через 0, 15, 30, 60 та 120 хв після ін’єкції. Невимірна висока концентрація глюкози (> 600 мг/дл) була зафіксована при 600 мг/дл. Всі аналізи, за винятком GTT, проводили в режимі ad libitum.
Гістологія
Жирову тканину фіксували в 4% розчині параформальдегідфосфатного буфера протягом 24 годин при кімнатній температурі. Депарафінізовані зрізи (2 мкм) інкубували з протеїназою К протягом 5 хв для отримання антигену. Ендогенну пероксидазну активність блокували 0,3% H2O2 у метанолі протягом 30 хв. Для оцінки інфільтрації макрофагів та виявлення ІЛ використовували щуряче антитіло до F4/80 (клон: A3-1, розведення 1: 1000: AbD Serotec) та кроляче антиполіклональне антитіло IL-15 (1 мкг/мл, PeproTech). -15 експресують клітини в жировій тканині відповідно. Кількість коронкоподібних структур підраховували в 15 різних полях (× 200) на слайд і виражали як середнє число на поле. Позитивну площу IL-15 вимірювали в 15–18 різних полях (× 200) на слайді, використовуючи Image J. Розмір адипоцитів визначали кількісно за допомогою програми Фіджі (Image J) Adiposoft 1.13, як описано раніше 3 .
Культура клітин
Клітини 3T3-L1 були придбані у ATCC і зберігались у модифікованому Дульбекко середовищі Eagle (DMEM), що містить 10% телячої сироватки. Через два дні після досягнення 100% злиття клітини інкубували в DMEM, що містить 10% бичачої сироватки плода (FBS), 5 мкг/мл інсуліну, 0,5 мМ ізобутилметил ксантину та 0,25 мкМ дексаметазону (0 день). Через 2 дні середовище замінювали DMEM, що містить 10% FBS і 5 мкг/мл інсуліну (день 2). Потім живильне середовище кожні 2 дні замінювали DMEM, що містить 10% FBS. Диференційовані адипоцити стимулювали рекомбінантним мишачим IL-15 (50 або 250 нг/мл, Peprotech) у дні 10, 12 та 14, як описано раніше 14 із деякою модифікацією. На 15 день диференціації клітини фіксували 4% розчином параформальдегідфосфатного буфера протягом 2 год при кімнатній температурі і промивали 60% ізопропанолом протягом 1 хв. Фіксовані клітини фарбували відфільтрованим розчином Олійно-червоного O протягом 2 год при кімнатній температурі. Для кількісної оцінки вмісту ліпідів Oil Red O елюювали 100% ізопропанолом, а поглинання екстрактів вимірювали при 540 нм за допомогою мікропланшетного зчитувача (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).
Для виділення перитонеальних макрофагів 12-тижневим самцям мишей WT інтраперитонеально вводили 3% -ний тіогліколят Brewer. Через чотири дні макрофаги збирали шляхом перитонеального промивання з використанням холодного DMEM, що містить 2% FBS. Клітини культивували протягом 3 год у DMEM, що містив 0,25% бичачого сироваткового альбуміну (BSA) та 1% пеніциліну/стрептоміцину. Культури двічі промивали забуференним фосфатом фізіологічним розчином (PBS) для видалення неадгезивних клітин, попередньо оброблених BHB (1 або 10 мМ) у культуральному середовищі та стимулювали ліпополісахаридом (LPS, 1 нг/мл), IL-4 (10 нг/мл, Biolegend), або IL-13 (10 нг/мл, Biolegend) протягом ночі.
Виділення адипоцитів та клітин судинної фракції судин
Епі зважували, подрібнювали і розщеплювали у 15 мл розчину колагенази типу 2 (2 мг/мл, Вортінгтон) протягом 20 хв при 37 ° С при обережному струшуванні. Суміш для травлення центрифугували при 500 g протягом 3 хв. Плавучі адипоцити збирали для екстракції рибонуклеїнової кислоти (РНК), а гранули, що містять клітини судинної фракції строми (SVF), суспендували в PBS. Суспензію пропускали через 100-мкм нейлоновий сітчастий фільтр (BD Falcon) і центрифугували при 500 g протягом 3 хв для осадження клітин SVF.
Виділення лейкоцитів периферичної крові
Зразки крові отримували з хвостової вени за допомогою капілярних трубок. Кров змішували з 0,5 М етилендіамінтетраоцтовою кислотою (EDTA), лізували за допомогою лізингового буфера ACK і центрифугували при 500 g протягом 3 хв.
Проточна цитометрія та сортування клітин
Ізольовані клітини SVF або лейкоцити ресуспендували в 200 мкл PBS, що містить 0,25% BSA, 0,2 мМ EDTA та 1% пеніциліну/стрептоміцину. Клітини попередньо інкубували протягом 7 хв при 4 ° C у блоці Fc (CD16/32, BD Biosciences), а потім фарбували протягом 15 хв кон'югованими флуорофором антитілами при 4 ° C. Були використані такі антитіла: анти-CD45 (клон: 30-F11, Biolegend), анти-F4/80 (клон: BM8, Biolegend), анти-CD11b (клон: M1/70, Biolegend), анти-CD11c (клон: N418, Biolegend), анти-CD206 (клон: C068C2, Biolegend), анти-CCR2 (клон: SA203G11, Biolegend), анти-Ly6G/Ly6C (клон: RB6-8C5, Biolegend) та анти-CD115 (клон: AFS98, Biolegend) 15. Проточний цитометричний аналіз проводили за допомогою FACSCantoII (BD Biosciences). Сортування клітин проводили за допомогою FACSAriaII (BD Biosciences). Дані аналізували за допомогою програмного забезпечення FlowJo (v9.4.10, Tree Star).