Зниження печінкового лактотрансферину викликає печінковий стеатоз при хронічній безалкогольній жирній печінці
Професор БуХюн Юн
Відділ біологічних наук,
Пусанський національний університет Busandaehak-ro 63 beon-gil,
Geumjeong-gu, 46241 Пусан (Корея)
Тел. 82-51-510-2264, факс 82-51-581-2962, електронна пошта [email protected]
Статті, пов’язані з "
- Електронна пошта
Анотація
Вступ
Лактотрансферрин (Ltf) - це залізозв’язуючий глікопротеїн, що виділяється в молоко та інтерстиціальні рідини і, як повідомляється, має різні функції, включаючи протизапальну, -біотичну, -оксидантну, -вірусну та -канцерогенну дії [13]. Крім того, раніше було показано, що введення Ltf зменшує накопичення ліпідів у печінці та полегшує НАЖХП на мишачих моделях [13, 14]. Більшість досліджень ролі Ltf у запобіганні НАЖХП було проведено десять років тому, і було виявлено, що Ltf запобігав НАЖХП, пригнічуючи поглинання хіломікрону [15]. Більше того, у структурному дослідженні пояснили, що Ltf містить багату аргініном область, яка була подібною до місця аполіпопротеїну Е (ApoE), що зв'язується з ліпопротеїновим рецептором низької щільності (LDLr), пов'язаним з LDLr білком 1 (LRP-1) або ліполізом -стимульований ліпопротеїновий рецептор (LSR) [16]. В недавньому дослідженні було підтверджено, що Ltf зв'язується з LSR та інгібує кліренс хіломікрону за допомогою експериментів з блотгандами лігандів [17]. Однак роль експресії Ltf в печінці в регуляції NAFLD та механізм регуляції експресії Ltf все ще не з'ясовані.
Встановлення відповідної моделі тварин є важливим для доклінічних досліджень. У дослідженнях з вивчення механізму розвитку НАЖХП багато в природних умовах Моделі NAFLD були створені за допомогою дієт, що включають дієти з високим вмістом фруктози, жиру та МКД (з дефіцитом метіоніну та холіну), або за допомогою генетичної модифікації, включаючи надмірну експресію SREBP-1c або приглушення PPARα [18]. Підходи до створення нової моделі NAFLD послідовно пропонувались у дослідженнях з метою з'ясування молекулярного механізму NAFLD. Однак моделі зазвичай демонстрували сильне накопичення печінкових ліпідів протягом декількох днів, що занадто коротко, щоб імітувати початковий печінковий стеатоз пацієнтів, навіть враховуючи різницю в масштабі часу у людини та мишей [19]. Оскільки розвиток НАЖХП проводився у пацієнтів протягом декількох місяців, хронічно розвивається модель НАЖХП може показувати під молекулярними подіями печінки гострі моделі. Крім того, використання індукованих дієтою моделей НАЖХП не може визначити рушійну силу НАЖХП, виявлену у пацієнтів без ненормального харчування та генетичних мутацій. Отже, хронічна та незалежна від дієти модель НАЖХП може подолати обмеження існуючих моделей мишей НАЖХП.
У цьому дослідженні ми провели дослідження для виявлення механізму початкового стеатозу печінки шляхом встановлення нової моделі миші NAFLD з опроміненням всього тіла на основі попередніх досліджень. Потім ми проаналізували транскриптомні профілі печінки та продемонстрували молекулярний механізм стеатозу печінки.
Матеріали і методи
Клітинні лінії, культивування та трансфекція
В дослідженні використовували AML12 (нормальна клітинна лінія клітин гепатоцитів), MIHA та HL-7702 (нормальні клітинні лінії гепатоцитів людини). Клітинна лінія AML12 була щедро обдарована проф. Хун-Сік Чой (Національний університет Чоннам, Кванджу, Республіка Корея). Клітинна лінія MIHA була щедро обдарована проф. Сук Ву Нам (Католицький університет Кореї, Сеул, Республіка Корея). Клітинна лінія HL-7702 була щедро обдарована проф. Soon-Sun Hong (Медична школа Університету Інха, Інчхон, Республіка Корея). AML12 вирощували в DMEM/F-12, MIHA вирощували в DMEM, а HL-7702 вирощували в RPMI-1640, що містить 10% FBS, 100 U/мл пеніциліну і 100 мкг/мл стрептоміцину. Клітини інкубували у зволоженій атмосфері 95% повітря/5% атмосфери CO2 при 37 ºC.
Перехідна трансфекція була проведена за попереднім дослідженням [25]. Коротко, суміш Lipofectamine TM (Invitrogen, Carlsbad, CA) та pCMV6-Ltf (Origene Technologies, Rockville, MD) інкубували 30 хв для утворення ліпосом і наносили на клітини MIHA або HL-7702 протягом 12 годин. Після обміну свіжими середовищами клітини використовували для подальших експериментів.
Антитіла та реактиви
Первинні антитіла, специфічні для Ltf, p-Stat5, Stat5, α-тубуліну, були придбані у компанії Santa Cruz Biotechnology (Санта Круз, Каліфорнія). Вторинні антитіла, специфічні для IgG миші, IgG кролика та IgA кози, були придбані у Enzo Life Sciences (Ann Arbor, MI). Гормон росту (ГР) був придбаний у Prospec (East Brunswick, NJ), а куместрол - у Enzo Life Sciences.
Протокол тварин та опромінення
Експерименти на тваринах проводили за попереднім дослідженням [26, 27]. Коротко кажучи, 3-тижневих самців мишей C57BL/6 було придбано у Orient Bio Inc. (Пусан, Республіка Корея). Протоколи тварин були схвалені Інституційним комітетом з догляду та використання тварин Національного університету Пусан (Пусан, Республіка Корея) та виконувались відповідно до положень Керівництва NIH з догляду та використання лабораторних тварин. Мишей утримували індивідуально або групами до п’яти осіб у стерильних клітках. Тварин утримували у приміщеннях для догляду за тваринами в кімнаті з регульованою температурою (23 ± 1 ° C) протягом 12-годинного циклу світло/темнота, розподіляючи та рандомізуючи для експериментів техніком закладу, та карантину протягом 1 тижня до вивчення. Тварин годували водою та звичайною дієтою для миші з чау-чаєм. Для експериментів на тваринах для генерування моделі миші NAFLD, спричиненої дієтою, мишей годували дієтою з високим вмістом фруктози (60% фруктози у вазі), високим вмістом жиру (60% калорій з жиру) або дієтою MCD.
Мишей знеболювали перед опроміненням і піддавали одноразовому опроміненню 6 Гр гамма-випромінювання, виробленого екстрактором Gamma Cell 40 (Nordion International Inc., Каната, Онтаріо, Канада). Опромінених мишей інкубували протягом 5 тижнів і інтраперитонеально вводили GH (2 мкг/г · день) або куместрол (0,5 мкг/г · день) згідно з експериментами. Мишей забивали після знеболення, а кров і печінку забирали для аналізу після попереднього дослідження [28]. Кров відбирали з серця, згортали і виділяли сироватку шляхом центрифугування (1500 г, 15 хв). Сироватка заморожувалась при -70 ºC до подальших експериментів. Печінку розрізали товщиною 4 мм і замочували в суміші оптимальної температури різання (OCT) (Sakura Finetek, Токіо, Японія) для гістологічного аналізу. Залишені зразки печінки безпосередньо заморожували у рідкому азоті, зберігали при -70 ºC до подальших експериментів.