Зростання Mycobacterium avium subsp
1 Laboratorio de Bacteriología, Grupo Sanidad Animal, EEA INTA, 7620 Balcarce, Аргентина
2 Facultad Ciencias Agrarias, UNMdP, CC 276, 7620 Balcarce, Аргентина
3 Facultad Ciencias Veterinarias, UNCPBA, Campus Universitario, Paraje Arroyo Seco, 7000 Tandil, Аргентина
Анотація
1. Вступ
Mycobacterium avium субсп. паратуберкульоз (MAP) є збудником паратуберкульозу або хвороби Джонна. MAP вражає домашніх і диких тварин, а у корів викликає хронічний ентерит, діарею, втрату ваги та прогресуюче виснаження, що з часом може призвести до смерті [1]. MAP також пов’язаний із хворобою Крона людини, системним розладом, який викликає головним чином хронічне запалення кишечника [2]. Припускають, що люди можуть заразитися через заражене молоко, хоча про виживання MAP під час маніпуляцій з промисловим молоком відомо відносно мало. Деякі автори припускають, що пастеризація здатна знищити мікобактерії. Таким чином, були проведені лабораторні дослідження для оцінки термостійкості MAP відповідно до диференціального розподілу термічної обробки під час пастеризації [3–6]. На відміну від цього, інші автори підтримують теорію про те, що MAP здатний протистояти пастеризації, коли він присутній у сирому молоці [7–13].
Дієздатний MAP був виявлений у комерційному пастеризованому молоці у Великобританії, США, Чехії та Індії [10, 11, 14–16]. Крім того, у Чеській Республіці, використовуючи F-57 або IS900 ПЛР у режимі реального часу, MAP було виявлено в 49% зразків сухого дитячого молока, в одному дослідженні отримано життєздатний MAP [17].
Тим не менше, мало публікацій щодо ПДК у молочних продуктах, крім рідини сухого молока та деяких сирів. Загалом, кисломолочні продукти створюють значні бар’єри для росту патогенів, починаючи з термічної обробки під час пастеризації, а потім додавання закваски та кислотного середовища під час бродіння, а також зберігання в холодильнику. ван Брандт та ін. інокулював MAP у молоко з надвисокою температурою (UHT) і спостерігав, що початковий показник MAP під час бродіння йогурту з подальшим зберіганням при 6 ° C залишався незмінним протягом 6 тижнів, незалежно від використовуваної закваски та вмісту жиру в молоці [18 ].
Метою цього дослідження було з'ясувати життєздатність MAP, Кишкова паличка, і . Ентеритидис під час традиційної обробки та зберігання йогурту в холодильнику з молока після експериментальної інокуляції та визначають, чи є синергетичний або антагоністичний ефект між цими бактеріями.
2. Матеріали та методи
2.1. Штами бактерій
Штами бактерій виділяли в лабораторії бактеріології Національного інституту сільськогосподарських технологій (INTA), м. Балькарс (Аргентина), використовуючи штам MAP INTA SB, виділений з товарного молока, Кишкова паличка штам INTA 116/C3, отриманий з бичачого калу, та S. Штам Enteritidis INTA 86/360, виділений з птиці.
2.2. Підготовка інокулятів
Для приготування інокулята вищезазначені штами розморожували від рідкого азоту. MAP культивували на твердому середовищі яєчного жовтка Herrold's (HEYM) плюс 0,0002% (мас./Об.) Мікобактину J (Allied Monitor Inc., Fayette, MO, США) та пірувату натрію (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA ) протягом 8 тижнів при 37 ° C. Для приготування інокуляту, декілька колоній суспендували в 15 мл забуференного фосфатом сольового розчину (PBS) (pH = 7), регульованого до каламутності 0,5 за шкалою Мак-Фарленда [25], що містить
колонієутворюючі одиниці
. Кишкова паличка був вирощений на агарі McConkey (MC) і S. Ентеритид культивували на агарі Xilosa-Lisina-Desoxicolato з додаванням 0,46% тергітолу-4 (Sigma Chemical Co., Сент-Луїс, Міссурі, США) (XLDT4). І агари MC, і XLDT4 інкубували протягом ночі при 37 ° C. Згодом одна колонія будь-якої Кишкова паличка або S. Ентеритид суспендували в PBS pH 7,2 і використовували для висіву відвару від інфузії мозку і серця (BHI) (Oxoid, Великобританія), який далі інкубували протягом ночі при 37 ° C. Для приготування інокуляту обидві пробірки BHI розбавляли PBS (pH = 7,2) до кінцевої концентрації колонієутворюючих одиниць .
2.3. Приготування йогурту
Три традиційні йогурти були приготовані з використанням 360 мл комерційного молока UHT, 125 г комерційного йогурту, що містить закваску Streptococcus thermophilus і Lactobacillus bulgaricus, і 5 мл відповідного бактеріального посіву: Йогурт 1 (Y1): КАРТА, Йогурт 2 (Y2): Кишкова паличка + S. Enteritidis, і Йогурт 3 (Y3): КАРТА + Кишкова паличка + S. Enteritidis. Ферментацію проводили в термостатичному орбітальному шейкері (New Brunswick Scientific, модель E24) при 43 ° C протягом 3 год. Потім йогурти зберігали при 4 ° С протягом 20 днів.
2.4. Зразки йогурту
Зразки по 50 мл відбирали до і протягом усього часу приготування через 20 хв, 45 хв, 65 хв, 90 хв, 115 хв, 135 хв, 155 хв, 180 хв і 270 хв. Крім того, зразки також відбирали під час зберігання через 4,5 год, 24 год, 48 год, 4 дні, 10 днів, 15 днів та 20 днів після щеплення.
2.5. Підрахунок живих бактерій
КАРТА. Для знезараження зразків застосовується спосіб, запропонований Tacquet et al. [26] використовували з деякими модифікаціями: 35 мл кожного йогурту центрифугували при 6000 об/хв протягом 20 хв у холодильній центрифузі (Sigma 16-K, Німеччина) і гранулу ресуспендували в 15 мл щавлевої кислоти при 5% (мас.)/об.). Зразки витримували при 37 ° С протягом 10 хв, а потім ще раз центрифугували. Потім гранулу ресуспендували в 2 мл PBS і, нарешті, 160 μL культивували в HEYM плюс ванкоміцин 0,01% (мас./Об.), Амфотерицин В 5% (мас./Об.), Налідіксинову кислоту 0,3% (мас./Об.) Та ністатин 0,01% (мас./Об.). Середовище інкубували при 37 ° C протягом 40 днів і спостерігали щотижня для зростання MAP. Остаточний КУО був розрахований з урахуванням того, що кожному нахилу прищеплювали 160 μЛ. Результати виражаються як йогурт.