AccQTag таAccQTag Ultra для деривітизації амінокислот Води
Аналіз амінокислот за допомогою рідинної хроматографії та оптичного виявлення вимагає додаткової підготовки зразків, оскільки більшість амінокислот не мають хромофору і їх неможливо виявити. Таким чином, після гідролізу наступним етапом аналізу амінокислот є дериватизація. Цей розділ описує підготовку білків або пептидних гідролізатів до дериватизації за допомогою Waters AccQ • Tag chemistry.
Для правильної та надійної дериватизації гідролізованого зразка необхідно враховувати наступне:
- Видалення твердих частинок
- Визначення маси зразка для дериватизації
- Визначення того, чи потрібна нейтралізація зразка
- Використання надлишку реагенту для дериватизації на основі маси зразка
Наступні обговорення скорочуються з необхідності. Для отримання додаткової інформації та вказівок щодо хімії дериватизації тегів відвідайте веб-сайт www.waters.com/AAA.
Центрифугування може знадобитися, якщо є велика кількість твердих частинок або плаваючих ліпідів. Центрифугування полегшує виведення аликвоти прозорого гідролізату для дериватизації.
Для зразків великого обсягу, таких як гідролізати аналізу корму, може бути достатньою фільтрація частинок, зазначаючи, що на вилучення зразків може вплинути вибір фільтруючого матеріалу. Цей фактор потрібно враховувати та розглядати, щоб отримати неупереджені результати. Зверніться до виробника фільтрів для отримання детальної інформації щодо продуктивності фільтрів у цій програмі.
Метод AccQ • Tag - це метод дериватизації перед колоною для амінокислотного аналізу гідролізованого пептиду та білків. Метод AccQ • Tag забезпечує наступне:
- Використовує Waters AccQ • Tag Ultra або AccQ • Реагент Fluor ™ для дериватизації амінокислот
- Відокремлює похідні за допомогою градієнтно-оберненофазної ВЕРХ або UPLC
- Точне кількісне визначення похідних за допомогою зовнішніх амінокислотних стандартів та оптичного детектування
Реагент 6-амінохіноліл-N-гідроксисукцинімідилкарбамату (AQC) реагує як з первинними, так і з вторинними амінами. Надлишок реагенту AQC реагує з водою з утворенням 6-амінохіноліну (AMQ). AMQ повільно реагує з надлишком реагенту AQC, утворюючи бісечовину. Ці побічні продукти не заважають розділенню, ідентифікації та кількісному визначенню амінокислот, що містяться в пептиді або білкових гідролізатах. Похідні стабільні протягом днів, дозволяючи пакетну обробку або повторний аналіз, якщо потрібно.
Протягом багатьох років проводились великі дослідження з метою забезпечення точності реакції виведення мітки AccQ. Сама хімічна реакція вимагає як молярного надлишку реагенту для дериватизації, так і основного рН (8–10) для повної дериватизації всіх амінокислот. Для вирішення цих критичних факторів були розроблені стратегії.
6.3.1 Визначення кількості зразка для AccQ • Дериватизація мітки
В самій реакції зразок, як правило, розбавляють 10 разів, і на колонку вводять 1 мкл із загального обсягу дериватизації 100 мкл. Оскільки при дериватизації не всі амінокислоти присутні в однаковій кількості, кількість зразка повинна бути достатньою, щоб найменш поширена амінокислота впливала на межу виявлення або кількісного визначення. Для отримання точного визначення кількості рекомендується дериватизація щонайменше 1 пмоль найменш поширеної амінокислоти в максимальному об'ємі ін'єкції 1 мкл. Щоб визначити кількість необхідної проби, виконайте наступний розрахунок:
➢ Приклад розрахунку:
Для концентрації зразка 1,0 мг/мл білка:
Оцініть кількість зразка, необхідного для найменш поширеної амінокислоти. У цьому прикладі ми вважаємо, що для доставки 1 пмоль на колонку цієї амінокислоти потрібно 0,03 мг/мл.
Крок 1: Визначте приблизну молярну концентрацію найменш поширеної амінокислоти.
Перетворення мг в моль (середня молекулярна маса амінокислотного залишку в білку становить 110).
Це розрахункова концентрація найменш поширеної амінокислоти в цій пробі.
Крок 2: Визначте розведення, необхідне для отримання 1 пмоль цієї найменш поширеної амінокислоти на колонці.
Це дає 27-кратне розведення (10 ÷ 0,37 = 27).
Гідролізат вимагає 27-кратного розведення перед дериватизацією. Наприклад: 5 мкл зразка гідролізату можна розбавити 135 мкл 0,1 н. HCl, щоб отримати це цільове значення.
Нарешті, аликвоту 10 мкл зазначеного вище розведення можна перенести у флакон з дериватизацією.
6.3.2 Нейтралізація для AccQ • Похідна мітка
Щоб забезпечити повну AccQ • Дериватизація реагентом міток амінокислот, що містяться в гідролізаті, зразок повинен бути забуферований в приблизному діапазоні рН від 8,2 до 10,1. Якщо гідролізат кислоти не буде нейтралізований належним чином, і якщо рН опуститься нижче 8,2, дериватизація буде неповною. Вплив рН змінюється для кожної амінокислоти. Зверніть увагу, що не всі амінокислоти впливають однаково. Кислі амінокислоти, такі як глутамінова кислота та аланін, впливають більше, ніж серин або фенілаланін. рН є критичним фактором для отримання точного визначення всіх амінокислот у вихідному зразку.
- Якщо розчин амінокислоти розчинений у 0.1N HCl, 10–20 мкл зразка можна перекласти безпосередньо в коктейль для дериватизації без регулювання рН. oте:Це все-таки необхідно, щоб забезпечити, щоб доступний дериваційний реагент був надлишковим, як описано нижче.
- Якщо розчин амінокислоти знаходиться у більш високій концентрації кислоти (> 0,1 Н HCl), його слід нейтралізувати рівним об'ємом гідроксиду натрію при тій же концентрації. Це може бути зроблено як додавання основного обсягу, або інтегровано на етапі дериватизації.
- Замініть необхідну кількість боратного буфера NaOH, щоб нейтралізувати HCl у зразку.
- У суміш для флаконів з реакцією дериватизації помістіть 10 мкл xM NaOH та 60 мкл борату. Додайте 10 мкл зразка АА (у xN HCl). Дериватизують за допомогою 20 мкл AccQ • Фторового реагенту.