Безглютенова дієта лише під час вагітності ефективно запобігає діабету у нащадків мишей NOD
1 Інститут Бартоліна, Rigshospitalet, 2200 Копенгаген, Данія
2 Лабораторія специфічного клітинного імунітету, Інститут мікробіології ASCR, 54922 Прага, Чеська Республіка
Анотація
Дослідження підтвердили, що на патогенез аутоімунного діабету впливає прийом глютену. Цілі. Дослідити важливість впливу глютену під час вагітності та подальшого розвитку аутоімунного діабету у нащадків. Методи. Мишей, які не хворіли на діабет, розділили на 7 груп, щоб отримувати комбінації безглютенової та стандартної дієти до, під час або після вагітності. Частота діабету у нащадків спостерігалась у кожній групі (
) протягом 310 днів. Оцінка інсуліту та експресія кишкових факторів транскрипції Т-клітин (RT-QPCR) оцінювались у тварин з різних груп харчування. Результати. Якби матерів годували безглютеновою дієтою лише під час вагітності, розвиток аутоімунного діабету у нащадків майже повністю запобігали зменшенню захворюваності з 62,5% у мишей, що споживають глютен, до 8,3% (
) у групі, що не містить глютену. Острівці Лангерганса були менш інфільтрованими () і кишковою експресією RORγt (Th17) () знижений у мишей, матері яких не мали глютену під час вагітності. Висновок. Безглютенова дієта виключно під час вагітності ефективно запобігає розвитку аутоімунного діабету у нащадків та зменшує інсуліт та експресію кишкового тракту в кишечникуγt (Th17).
1. Вступ
Вплив глютену є важливим фактором розвитку діабету 1 типу (T1D) [1]. Як у мишей без діабету (NOD), так і у щурів, що розмножуються на біорозведенні (BB-), безглютенова (GF) [2, 3] або гідролізована [4] дієта помітно знижує частоту захворювання. У людей нещодавно повідомлялося, що дієта із низьким вмістом вуглеводів із ГФ спричиняє ремісію у нещодавно діагностованого пацієнта із СД1 [5], а покращена секреція інсуліну спостерігається через 6 місяців дієти із ГФ [6]. Поява аутоімунітету бета-клітин може бути пов’язане з віком введення злаків у раціон для немовлят [7, 8]. Крім того, високий дієтичний вміст моносахаридів збільшує ризик розвитку T1D [9, 10].
Механізм впливу гліадину на розвиток захворювання невідомий. Ймовірно, що задіяний імунітет кишечника, оскільки ми [11] та інші [12, 13] повідомляли, що споживання глютену надає прозапальний цитокіновий профіль у багатьох регуляторних популяціях Т-клітин, включаючи γδ Т-клітини в лімфоїдних тканинах слизової. Цілком ймовірно, що цим змінам сприяють або навіть залежать від того, що глютенові пептиди здатні поперечно перетинати епітелій, що ми нещодавно продемонстрували у мишей NOD та BALB/c (не опубліковано) і про які раніше повідомляли у пацієнтів з T1D [14].
Також можливо, що прямий вплив пептидів глютену на бета-клітини може вплинути на розвиток захворювання. Ми показали, що 33-мерний гліадиновий пептид може безпосередньо закривати K-канал і індукувати секрецію інсуліну [15]. Хоча в даний час незрозуміло, чи взаємодіє гліадин безпосередньо з K-каналом, або сигнал передається через інші рецептори, такі як TLR4, ця клітинна активація може збільшити ризик розвитку хвороби через стрес бета-клітин [16].
Попередні експерименти з дієтою GF на тваринних моделях аутоімунного діабету [2, 3, 17] проводились на тваринах, які зазнавали дієти GF як під час вагітності, так і в період новонародженості. Однак потенціал клейковини впливати на діабетогенний процес, як видається, залежить від часу введення глютену як у тварин [12, 13], так і у людей [7, 8]. Отже, невідомо, чи існує критичний період, протягом якого ефект від дієти ГФ є найбільш ефективним, чи обидва часові інтервали однаково важливі. Це було досліджено в цьому дослідженні, яке показало, що дієта ГФ, виключно під час вагітності, набагато перевищує ефективність інших періодів лікування.
2. Методи
2.1. Тварини
Мишей утримували у спеціальному приміщенні для тварин, що не має патогенів (SPF) (температура
градусів, 12 год світлового циклу, зміна повітря 16 разів на годину та вологість
%) з вільним доступом до води та їжі. У клітках були гніздові матеріали та картонний притулок. Експерименти на тваринах проводились із дозволу Інспекції експериментів на тваринах (2012-15-2934-00086), а експерименти регулювались Директивою 2010/63/ЄС про захист тварин, що використовуються в наукових цілях.
2.2. Дієти
Тварини отримували або STD, неочищену дієту Altromin, або GF, модифіковану дієту Altromin (Altromin, Lage, Німеччина). Обидві експериментальні дієти були харчовими адекватними з однаковим рівнем білка, амінокислот, мінералів, вітамінів та мікроелементів, і лише джерело білка відрізнявся між ними. Точний склад дієти із ЗПСШ та ГФ наведено в таблиці 1. Вміст білка в дієті ГФ та дієті ЗПСШ були подібними (22,7% проти 22,9%). Білки в дієті із ЗПСШ отримували з пшениці (25%), кукурудзи та сої, тоді як джерелом білка для дієти GF було м'ясо та соєві білки. Дві дієти також мали однаковий вміст амінокислот, мінералів, вітамінів та мікроелементів. Вміст гліадину в дієті із ЗПСШ і ГФ (таблиця 1) вимірювали за допомогою конкурентного аналізу GlutenTox ELISA (Biomedal Diagnostics, Севілья, Іспанія). Вагу мишей контролювали, і обидві групи тварин демонстрували подібний розподіл ваги.
2.3. Захворюваність на діабет
Самки NOD щодня перевіряли на цукровий діабет і з 84-денного віку щотижня проводили скринінг на глікемію за допомогою моніторингу глюкози FreeStyle Lite (Abbott). Діагноз діабету базувався на двох позитивних показниках глікемії> 12 мМ з інтервалом у два дні. Дату першого позитивного показника глікемії використовували як дату початку діабету. Мишей вбивали при появі діабету або у віці 310 днів. Якщо тварини гинули з інших причин, це зазначалося, і значення під час розрахунку захворюваності виключались.
2.4. Оцінка інсуліту
П’ять мишей у кожній групі використовувались для оцінки балів інсуліту. Підшлункову залозу видалили, за ніч закріпили у 4% параформальдегіді, вклали у парафін та розділили на 4 μм зрізів, які згодом фарбували гематоксиліном та еозином. Зрізи оцінювали випадковим чином і засліплювали мікроскопією. Кожна секція оцінювалась з 0 по 4 за такою шкалою: (0) неушкоджені острівці, (1) периінсуліт, (2) помірний інсуліт (50% острівців проникли) і (4) острівці знищені.
2.5. Виділення РНК
Зразки цеюналу зберігали в РНК-пізніше (Sigma, США), а РНК виділяли за допомогою процедури TRIzol (Invitrogen, США). Тканини гомогенізували Polytron PT10-35 (Kinematica, Швейцарія) при середній швидкості протягом 10 с на льоду. РНК розчиняли у стерильній воді та осаджували ацетатом натрію. Якість та концентрацію вимірювали на спектрофотометрі NanoDrop 1000 (Thermo Scientific, США).