Citrobacter freundii тирозин-фенол-ліаза роль аспарагіну 185 у модулюючій функції ферменту

М.В. Барболіна, Р.С. Філліпс, П. Голлік, Н.Г. Фалєєв, Т. В. Демідкіна, Citrobacter freundii тирозин-фенол-ліаза: роль аспарагіну 185 у модулюванні функції ферменту за рахунок стабілізації хіноноїдного проміжного продукту.: //doi.org/10.1093/protein/13.3.207

тирозин-фенол-ліаза

Анотація

Вступ

Загальновизнаний механізм каталізу TPL представлений на схемі 1.

Матеріали і методи

Матеріали

Лактатдегідрогеназу з м’язів кроликів, піридоксаль-P та NADH закуповували в United States Biochemical (USB), як і l-тирозин, S-бензил-1-цистеїн та S-етил-1-цистеїн. З Sigma отримували β-хлор-l -аланін, l-фенілаланін, l-метіонін, l-аспарагінову кислоту та l-гомосерин. S-метил-1-цистеїн був продуктом біохімічних досліджень ICN. S- (о-нітрофеніл) -1-цистеїн (SOPC) готували, як описано раніше (Phillips et al., 1989). 3-фтор-1-тирозин отримували ферментативним синтезом (Phillips et al., 1990). [α- 2 H] -3-фтор-1-тирозин отримували шляхом ферментативного синтезу в 2 H2O, як було описано раніше для l-тирозину (Kilk and Phillips, 1988). [α, β, β- 2 H3] -3-фтор-1-тирозин отримували, як описано Faleev et al. (1996).

Підготовка TPL N185A

Сайт-специфічний мутагенез, орієнтований на олігонуклеотиди, проводили із застосуванням плазміди pTZTPL, яка містить ген tpl з C.freundii у pTZ18U (US Biochemical) (Antson et al., 1993). Одноцепочечну ДНК готували за допомогою фага-хелпера M13K07 (Vieira and Messing, 1987). Мутагенез, спрямований на сайт, проводили методом Taylor et al. (1985) з використанням набору для мутагенезу in vitro Sculptor від Amersham. Для проведення необхідної заміни Asn185 – Ala був підготовлений мутагенетичний олігонуклеотид 5′-AGTCACGGTTGCCCTCGCAGGCGG-3. Отримані плазміди скринірували шляхом дидеокси-секвенування (Sanger et al., 1977) в області мутації з використанням Sequenase (US Biochemical.) Та праймера, комплементарного нуклеотидам 1050–1073 у послідовності гена tpl, визначеної Antson et al. (1993). Плазміду, що несе зміну N185A, позначали pTZTPL N185A. Клітини Escherichia coli SVS370 використовували як господаря для плазміди. Клітини вирощували і фермент очищали, як описано раніше (Chen et al., 1995b). TPL дикого типу очищали від клітин E.coli SVS370, що містять плазміду pTZTPL, за тією ж процедурою.

Аналізи ферментів

Активність ферментів звичайно вимірювали за допомогою 0,6 мМ S- (о-нітрофеніл) - 1-цистеїну (SOPC) у 50 мМ фосфаті калію, рН 8,0, при 25 ° C (Phillips, 1987) шляхом зменшення поглинання при 370 нм ( Δε = –1,86 × 10 3 л/моль. См). Одиницю активності визначали як кількість ферменту, що каталізує трансформацію 1 мкмоль SOPC на хвилину.

Реакції β-елімінації вимірювали за допомогою зв’язаного аналізу з лактатдегідрогеназою та NADH, виміряним при 340 нм (Δε = –6,22 × 10 3 л/моль. См), як описано Morino and Snell (1970) для триптофанази. Реакційні суміші містили 50 мМ фосфату калію, рН 8,0, 50 мкМ піридоксаль-Р, 0,2 мМ НАДН, 0,02 мг лактатдегідрогенази та різну кількість амінокислотного субстрату в загальному обсязі 0,6 мл при 25 ° С. Реакцію ініціювали додаванням розчину ферменту. Визначення кінетичних параметрів для SOPC проводили при 25 ° C у 50 мМ фосфаті калію, рН 8,0, 5 мМ 2-меркаптоетанолу та 50 мкМ піридоксалю-P, з різними кількостями SOPC та відповідними розведеннями дикого типу та мутантного TPL.

Інгібуючу дію амінокислот на мутантну TPL визначали, використовуючи SOPC в якості субстрату, як описано вище.

Визначення білка

Білок визначали методом Lowry et al. (1951), використовуючи бичачий сироватковий альбумін як стандарт. Концентрацію очищеного TPL визначали з поглинання при 278 нм (E 1% = 8,37) (Muro et al., 1978), припускаючи молекулярну масу субодиниці 51,4 кДа (Antson et al., 1993).

Експерименти з обміну ізотопами

Реакції ізотопного обміну з l-фенілаланіном та l-метіоніном проводили в 50 мМ фосфатному буфері калію в присутності 0,1 мМ піридоксалю-Р в загальному обсязі 4 мл. РН розчину, виміряний потенціометрично за допомогою скляного електрода, дорівнював 8,2, що відповідає р 2 Н = 8,6 (Blesoe and Long, 1960). Концентрація 1-фенілаланіну становила 28,6 мМ, додавали 6,7 мг [N185A] TPL і аликвоти реакційної суміші виводили через 1, 2, 3, 5 і 7 год і нагрівали при 90 ° С протягом 5 хв для зупинки реакції а потім аналізували за допомогою 1 H ЯМР. У реакції з l-метіоніном концентрація останнього становила 132 мМ, додавали 3,34 мг [N185A] TPL і аликвоти виймали через 5, 8, 26, 35 та 51 год і обробляли, як зазначено вище. Співвідношення дейтерованих до недейтерованих продуктів розраховувалося на основі відносної інтегральної інтенсивності сигналів групи α-протона та β-CH2, причому остання використовується як внутрішній стандарт.

Вимірювання зупиненого потоку

Перед проведенням швидких кінетичних експериментів основний фермент інкубували з 1 мМ піридоксалем-P протягом 1 години при 30 ° C при рН 7,0, а потім відокремлювали від надлишку піридоксалю-P, використовуючи коротку колонку для знесолення (PD-10, Pharmacia), збалансовану Вимірювали 50 мМ фосфату калію, рН 8,6 та активність препарату. Втрати активності не спостерігалося. Кінетичні дані швидкого сканування зупиненого потоку були отримані за допомогою приладу RSM від OLIS. Цей інструмент має мертвий час

2 мс і здатний збирати спектри у видимій області від 300 до 600 нм на частоті 1 кГц. Розчини ферментів у 50 мМ фосфаті калію, рН 8,6, змішували з різними концентраціями амінокислот і спостерігали за змінами абсорбції при 500 нм. Константи швидкості оцінювались за допомогою експоненціальної підгонки за допомогою програм LMFT або SIFIT, наданих OLIS. Термін придатності оцінювали за стандартним відхиленням або параметром Дурбіна – Ватсона. Як правило, константи швидкості оцінювали до стандартного відхилення (Strickland et al., 1975), використовуючи Enzfitter (Elsievier), де kf і kr - це пряма і зворотна константи швидкості відповідно.

де Kp - спорідненість ферменту до дейтерованого продукту, а [S] 0 - початкова концентрація субстрату.