Економна процедура очищення жирової подушки молочної залози мишей від епітеліальних компонентів для трансплантації
Інформація про статтю
Анотація
Резюме
Трансплантація клітин епітелію в очищені жирові прокладки є широко застосовуваною методикою вивчення біології молочних залоз. Вперше він був описаний в 1959 р. І досі залишається цінною методикою, останньою разом з аналізом алагену молочної залози від нокаутованих мишей з ембріональним летальним фенотипом або репродуктивним дефектом, а також для аналізу стовбурових клітин молочних епітеліїв або аналізу передракових клітин. Молочні залози, на відміну від більшості інших органів, в основному розвиваються постнатально. Коли невелика кількість ендогенного епітелію, що міститься в жировій подушці препубертатної миші, видаляється, цей кліренс залишає природне мікросередовище, яке можна повторно заселити екзогенно забезпеченими епітеліальними клітинами. Клітини з відповідним потенціалом розвитку (стовбурові клітини або клітини-попередники) можуть регенерувати епітеліальну частину молочної залози після статевого дозрівання та вагітності. Звичайний кліренс жирової прокладки - це хірургічна процедура. Ми вдосконалили техніку та мінімізували час хірургічного втручання та відновлення, зберігаючи при цьому ефективне видалення ендогенного епітелію з жирової прокладки молочної залози.
Трансплантація клітин у очищені жирові подушечки миші часто використовується для вивчення поведінки стовбурових клітин епітеліальних молочних залоз або для аналізу ефектів генетичних змін на ріст, диференціацію та апоптоз молочних залоз. Легкодоступна структура молочної залози та той факт, що залоза не є життєво важливим органом, робить ці експерименти можливими. Спосіб був вперше описаний DeOme та ін. (1959). Експериментальний курс вимагає видалення ендогенного епітелію з жирової подушечки молодих мишей; Потім тканинні фрагменти або клітинні суспензії можуть бути введені в очищену жирову прокладку. Ці трансплантовані клітини можуть рости, диференціюватись і утворювати протокове дерево, яке майже не відрізняється від ендогенного.
Хоча техніка очищення та трансплантації молочних залоз була розроблена наприкінці 1950-х років, все ж найбільш корисно відповісти на багато сучасних експериментальних питань. Трансплантація клітин у жирову прокладку та подальший аналіз отриманих структур використовувались для оцінки їх властивостей стовбурових клітин та їх регенеративної здатності (див. Smith & Boulanger 2003, Visvader 2006 та посилання на них). Клітини, які були змінені ретровірусними інфекціями, були проаналізовані для оцінки наслідків експресії онкогену на молочній залозі (Edwards 2000) та надали уявлення про пухлинні пухлини молочної залози (Daniel та ін. 1968, Медіна 1976, Едвардс та ін. 1996).
Трансплантація фрагментів тканин молочної залози від трансгенних або нокаутованих мишей у очищені жирові прокладки мишей дикого типу застосовувалася, коли генетична маніпуляція призвела до стерильного тваринного або ембріонального летального фенотипу. Жирне середовище мишей дикого типу забезпечує нормальні умови розвитку, і, таким чином, можна виділити фенотипові ефекти, що походять від генетичних змін в епітеліальному або стромальному відділах (Klinowska & Streuli 2000, Parmar & Cunha 2004).
Передракові клітини молочної залози миші можна підтримувати та спостерігати їх раковий прогрес у очищеному жировому прокладку (Кардіфф та ін. 2006). Також можна гуманізувати жирову прокладку для підтримки нормального та ракового росту клітин епітеліальних клітин молочної залози людини (Kuperwasser та ін. 2004, Лю та ін. 2006).
Миші мають 10 молочних залоз, по п’ять з кожного боку, розташованих вентро-латерально. Їх можна розрізнити як грудні залози, цифри 1–3, і пахові залози, цифри 4 і 5. Пахові залози номер 4 є найлегшими для доступу, і тому їх зазвичай використовують для очищення та трансплантаційних експериментів.
У ембріона миші, що розвивається, можна спостерігати невеликий приріст молочної залози. Залозисте дерево виростає в період статевого дозрівання, а функціональна диференціація відбувається у дорослій залозі під час вагітності та лактації. Проліферація епітеліальних клітин і розширення епітеліальних проток заповнюють подушечку під час статевого дозрівання. Кінцеві бруньки терміналу необхідні для розширення проток під час статевого дозрівання. Під час вагітності визначаються альвеолярні клітини, які диференціюються в секреторні клітини, що синтезують молочні білки. Після припинення лактації молочна залоза зазнає запрограмованої загибелі та ремоделювання клітин, відомого як інволюція, повертаючись до стану, порівнянного з незайманою залозою (Hovey & Trott 2004).
Перед тим, як клітини можна пересадити, необхідно повністю видалити ендогенну епітеліальну тканину з подушечки. Це найбільш практично можливо з перших трьох тижнів після народження. Протягом цього часу протокова структура обмежена безпосередньо до соска. Після статевого дозрівання протоки простягаються до країв молочної жирової прокладки, і їх неможливо повністю видалити, не руйнуючи жирову подушку. Після видалення епітеліальних клітин залишок жирової прокладки молочної залози є мікросередовищем, сприятливим для проліферації та диференціації епітелію. Якщо епітеліальні клітини залишаються після очищення, вони можуть виростати разом із трансплантованими клітинами і ускладнювати інтерпретацію гістологічного аналізу.
Сучасний хірургічний метод передбачає видалення анлажу за допомогою розсікаючого мікроскопа (рис. 1а – с). Шкіра живота відкривається великим Y-фігурний розріз. Ущільнення молочної залози витягують тією частиною жирової прокладки, яка знаходиться найближче до соска. Поживні кровоносні судини і область соска припікаються, а також з'єднання з п'ятою паховою залозою, і рана закривається. Клітини протоки безпосередньо під соском залишаються і можуть забруднити трансплантат, якщо сосок залишився в шкірі. Довжина розрізу становить кілька сантиметрів, і велика кількість тканини від’єднана від тіла.
Рисунок 1 Порівняння старих та нових методів очищення жирової тканини молочної залози. Старий метод: (а) Лінії розрізу для класичного способу очищення жирової моди молочної залози. (b) Після надрізу шкіру складають назад, щоб оголити всю молочну залозу. Цю ж процедуру буде повторено на контралатеральній стороні. (c) Рана закрита за допомогою шести затискачів Мішеля. Новий метод: (d) кола навколо соска позначають розріз для резекції соскоподібного виступу. (д) Висікається шкіра навколо соска, оголюється сосок і лише частина жирової прокладки молочної залози. (f) Рана закрита двома затискачами Мішеля
Ми змінили процедуру, щоб мінімізувати рану після операції і одночасно досягти високого рівня успішності очищення жирових прокладки. Ми представляємо різновид оригінального методу, описаного DeOme та ін. (1959), що можна вважати менш шкідливим для тварин та вдосконаленням техніки.
Матеріали і методи
Тварини
Самки мишей C57BL/6NCrl, BALB/cAnNCrl (Чарльз-Рівер, Сульцфельд, Німеччина) та трансгенних мишей із покращеним зеленим флуоресцентним білком (EGFP) (C57BL/6Tg (ACTB-EGFP) Osb, Jackson Labs, Bar Habor, ME, USA). відповідно до німецького законодавства про добробут тварин та вказівок щодо утримання тварин від Федерації європейських лабораторних асоціацій наук про тварин (FELASA). Давали їжу та воду ad libitum. Тварин утримували у відкритих клітках або індивідуально провітрюваних клітках. Експерименти на тваринах були розглянуті комітетом з питань добробуту тварин в Регієрунгспрессідіумі Дармштадт.