Ексенатид захищає від індукованої глюкозою та ліпідами ендотеліальної дисфункції
Анотація
Вступ
Ендотеліальна дисфункція відіграє вирішальну роль у розвитку атеросклерозу та серцево-судинних подій (1–3). Він присутній при цукровому діабеті 2 типу (4,5) і пов’язаний із концентрацією глюкози та тригліцеридів у крові після їжі (6–8). Як постпрандіальна гіперглікемія, так і гіпертригліцеридемія покращуються агоністами рецепторів GLP-1 (GLP-1R) (9–13), вказуючи на потенціал цих ліків від діабету для покращення функції ендотелію (ЕФ).
У нашому попередньому дослідженні одна ін’єкція екзенатиду агоністу GLP-1R пригнічувала підвищення концентрації глюкози та тригліцеридів після їжі та покращення EF після одноразового прийому їжі з високим вмістом жиру у пацієнтів із порушеннями толерантності до глюкози (IGT) та нещодавно діагностованого, контрольованого дієтою типу 2 діабет (14). Хоча поліпшення ЕФ було подібним у пацієнтів з ІГТ та діабетом, закономірність зміни ФВ виявилася різною, і в той час як пацієнти з ІГТ продемонстрували абсолютне збільшення постпрандіальної вазодилатації ексенатидом, у пацієнтів з діабетом спостерігалося покращення зниженого ЕФ, спричиненого їжею . Чи може ексенатид покращити ЕФ у пацієнтів з діабетом 2 типу протягом наступних прийомів їжі та чи будуть ці судинні переваги у пацієнтів із цукровим діабетом 2 типу тривалішої та, можливо, більшої судинної дисфункції, багато в чому.
Хоча ми виявили, що частина ефекту екзенатиду на ЕФ пояснюється зниженням концентрації тригліцеридів у плазмі крові (14), деяке покращення ЕФ, викликане ексенатидом, не залежить від зниження рівня глюкози та тригліцеридів у плазмі, підтримуючи концепцію прямого, ендотелій-залежне вазорелаксація агоністами GLP-1R (15–24). Пряма судинна дія агоніста GLP-1R може включати кілька механізмів. Тоді як попередні дослідження на гризунах припускали роль не опосередкованого GLP-1R шляху, що активується головним чином продуктами розпаду GLP-1 (19,20), більш пізні дані in vitro та in vivo вказують на пряму дію через ендотеліальні GLP-1R ( 22,24). На підтвердження останнього, кілька кіназних шляхів, відомих для активації ендотеліальної оксиду азоту (NO) -синтази (eNOS) та збільшення вироблення NO, in vitro регулюються різними агоністами GLP-1R (25–28). Однак, який із цих специфічних пострецепторних шляхів може врахувати вплив ексенатиду на ЕФ у людини, залишається в основному невідомим.
Для роз’яснення цих питань ми вивчали 1) чи має ексенатид сприятливий вплив на ЕФ під час послідовних прийомів їжі при цукровому діабеті 2 типу, 2) чи виникають ці ефекти у пацієнтів із більш усталеним діабетом 2 типу, та 3) якою мірою можуть бути ефекти ексенатиду пояснюється безпосередньою дією ексенатиду через GLP-1R. Крім того, ми досліджували молекулярні шляхи, відповідальні за дію агоніста GLP-1R, використовуючи артеріоли людини та ендотеліальні клітини.
Дизайн та методи дослідження
Два рандомізованих подвійних сліпих перехресних дослідження були схвалені комісією з огляду інституцій. Усі суб'єкти надавали інформовану згоду до участі. Пацієнти в обох дослідженнях отримували стабільні дози артеріального тиску та ліпідознижуючі препарати протягом 3 місяців до зарахування.
Дослідження 1
Дослідження 2
Учасники з IGT або нещодавно діагностованим (am. Після базового вимірювання ЕФ катетери розміщували відповідно в антекубітальній вені (для вливання ліків) та дорсальній вені кисті (для забору крові) домінуючої та недомінантної руки. Шістдесят хвилин після базового вимірювання ЕФ, розпочато грунтовану (6000 пмоль/л/кг) безперервну (600 пмоль/л/кг ⋅ хв) інфузію екзендіну-9 (Бахем, Бюбендорф, Швейцарія) або еквівалентного об'єму фізіологічного розчину. Через тридцять хвилин після цього внутрішньовенна інфузія було введено екзенатид (50 нг/хв) або еквівалентний об’єм плацебо. Показано, що така швидкість інфузії ексенатиду забезпечує швидку та стабільну концентрацію, подібну піковій концентрації після типових підшкірних ін’єкцій ексенатиду (30). спеціальний фармацевт для забезпечення того, щоб дослідний персонал залишався засліпленим. Вимірювання ЕФ повторювали через 30 хв під час інфузії ексенатиду/плацебо. Внутрішньовенне застосування екзендіну-9 та ексенатиду було схвалено в США Управління з контролю за продуктами та ліками IND 108.117 (J.K.). Зразки крові для вимірювання глюкози та інсуліну відбирали перед кожним кроком інфузії та за 10 хв до другого вимірювання ЕФ, після чого лінію забору крові відбирали, щоб уникнути можливих перешкод у вимірюванні ЕФ.
Вимірювання EF
EF оцінювали за допомогою периферичної артеріальної тонометрії (PAT) (ENDO-PAT2000; Itamar Medical, Кесарія, Ізраїль), як було детально описано раніше (14). Безперервні пульсуючі реакції об’єму крові обох вказівних пальців реєстрували протягом 5-хвилинного періоду врівноваження, 5-хвилинного періоду, включаючи супрасистолічне роздування манжети артеріального тиску на недомінантній руці, та 5-хвилинного періоду після інфляції. Значення індексу реактивної гіперемії (РЗІ) нормалізували на показники з контралатеральної групи. Середній внутрішньопредметний коефіцієнт варіації вимірювання RHI у нашій лабораторії становить 3% того самого дня послідовно та 10% у два окремі дні.
Дослідження ендотеліальних клітин
Ендотеліальні клітини аорти людини (HAEC) та ендотеліальні клітини пуповинної вени (HUVEC) (Lonza; CC-2535 та CC-2517, відповідно, Walkersville, MD) підтримувались в ендотеліальному базальному середовищі (CC-3162; Lonza) з доповненим ростом коефіцієнтів при 37 ° С у зволоженому інкубаторі, доповненому 5% СО2.
Пасаж 6–8 HAEC при 90–95% злиття обробляли екзендіном-4 (тобто ексенатидом) з попередньою обробкою або без неї сполукою-С інгібітора AMPK (СС) або екзендіном-9 (Sigma-Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі) промивають PBS і лізують відповідними інгібіторами фосфатази та протеази. Загальний і фосфорильований AMPKα (сайт фосфорилювання Thr172), cAMP-залежну протеїнкіназу (PKA, Thr197), Akt-кіназу (Ser473) та eNOS (Ser1177) вимірювали за допомогою Вестерн-блот, використовуючи антитіла від Cell Signaling Technology (Beverly, MA) і нормалізується до α-тубуліну.
AMPKα1-специфічні малі заважаючі РНК (siРНК) (TriFECTa Kit; IDT Inc., Coralville, IA) або контрольні siRNA (IDT Inc.) були використані для вивчення того, чи AMPK опосередковує ефекти виробництва NO. HUVEC використовували для полегшення трансфекції з використанням реагенту для трансфекції HiPerFect (Qiagen, Валенсія, Каліфорнія). Пасаж 3–5 клітин при з’єднанні 75–80% трансфікували протягом 24 годин міРНК анти-AMPKα1 або контрольну міРНК перед обробкою 10 нмоль/л екзендіну-4.
NO вимірювали за допомогою 4,5-діамінофлуоресцеїн-діацетату (DAF-2DA; Calbiochem, EMD Millipore, Billerica, MA). HAEC та HUVEC, які досягли злиття 80% на 24-лункових планшетах, інкубували з 5 мкмоль/л DAF-2DA протягом 15 хв до завершення відповідної обробки, промивали PBS (pH 7) і фіксували в 4 % параформальдегіду. Пластини були зображені на EVOS (Life Technologies, Grand Island, NY), а інтенсивність флуоресценції NO аналізували за допомогою ImageJ.
Дослідження вазореактивності
Лабораторні дослідження
Концентрацію глюкози в плазмі крові вимірювали біля ліжок за допомогою аналізатора глюкози YSI 2700D (Yellow Springs, OH). Зразки для інших вимірювань у плазмі або сироватці зберігали при -80 ° C до аналізу на вміст ліпідів у плазмі (Еббот, Лейк-Форест, Іллінойс), інсуліну в плазмі (EMD Millipore), аполіпопротеїну B48 (apoB48; Biovendor, Asheville, NC) та ацетамінофену ( Імуналіз, Помона, Каліфорнія) та концентрації d-ксилози (34).