Експресія індукованого гіпоксією фактора-1α в мозку щурів під час хронічної гіпоксії

Кафедри анатомії та

Неврологія, Університет Кейс Вестерн Резерв, Медичний факультет, Клівленд, Огайо 44106

Анотація

Індукований гіпоксією фактор-1 (HIF-1) - це фактор транскрипції, який регулює адаптаційні реакції на нестачу кисню в клітинах ссавців. HIF-1 складається з двох білків, HIF-1α та HIF-1β. HIF-1α накопичується в гіпоксичних умовах, тоді як HIF-1β конститутивно експресується. Експресію HIF-1α та HIF-1β вимірювали під час адаптації до гіпобаричної гіпоксії (0,5 атм) у корі головного мозку щурів. Вестерн-блот-аналізи показали, що HIF-1α швидко накопичувався під час настання гіпоксії і не падав протягом 14 днів, а впав до норми на 21 день, незважаючи на постійну низьку артеріальну напругу кисню. Імуноофарбовування показало, що нейрони, астроцити, епендимальні клітини та, можливо, ендотеліальні клітини є типами клітин, що експресують HIF-1α. Гени з елементами, що реагують на гіпоксію, активувались у цих умовах, про що свідчать підвищені фактори росту судинного ендотелію та рівні мРНК транспортера глюкози. Коли 21-денно пристосовані щури піддавалися більш серйозному гіпоксичному впливу (8% кисню), HIF-1α накопичувався знову. На підставі цих результатів ми припускаємо, що ремоделювання судин та метаболічні зміни, викликані тривалою гіпоксією, здатні відновити нормальний рівень кисню в тканинах.

Вплив навколишнього середовища з низьким вмістом кисню викликає кілька безпосередніх і довгострокових адаптаційних механізмів. На системному рівні вони включають гіпервентиляцію та поліцитемію, які покращують доставку кисню до таких важливих органів, як мозок (15, 20). Однак цих компенсаторних механізмів недостатньо для задоволення потреб центральної нервової системи в кисні, особливо під час тривалого впливу гіпоксії. Мозок виявляє неабияку здатність до структурної та метаболічної реакції на тривалу гіпоксію. Однією з найдраматичніших структурних реакцій є значне перероблення мозкової мікросудинної мережі. Попередні дослідження показали, що 3 тижні впливу гіпобаричної гіпоксії спричиняли значне збільшення щільності мікросудин у мозку (2, 9, 15,19). Ця структурна пластичність також супроводжується метаболічною адаптацією до низького напруги кисню. Наприклад, повідомлялося про збільшення транспорту глюкози (7), збільшення загального обміну метаболізму глюкози (10) та активність цитохромоксидази (4,14) у мозку щурів після 3 тижнів впливу гіпобаричної гіпоксії.

Під час тривалого впливу гіпоксії HIF-1α слід виражати до тих пір, поки не буде досягнутий баланс між надходженням та використанням кисню в тканині. Наші результати показали, що рівні HIF-1α повертаються до нормоксичних значень після 3 тижнів гіпоксії, припускаючи, що ремоделювання судин головного мозку та метаболічні зміни змогли компенсувати гіпоксію тканин мозку.

Вплив хронічної гіпоксії.

Самців щурів Wistar у віці 2–3 місяці утримували до 3 тижнів у гіпобаричних камерах, що підтримували тиск 380 Торр (0,5 атм, що еквівалентно 10% нормобаричному кисню). У групах, що утримувались більше 1 дня, камери відкривали 30 хв щодня для очищення клітини та поповнення їжі та води. Тривалість гіпоксії становила 6 год, 12 год або 1, 4, 7, 14 або 21 день. Кожна експериментальна група щурів мала свою власну контрольну групу для сміття, яку тримали поза гіпобаричними камерами, але в тому ж місці. Група щурів, що утримувалася 21 день у гіпобаричній камері, піддавалась дії 10% або 8% нормобаричного кисню протягом 4 год відразу після вилучення з гіпобаричної камери. Зразки венозної крові хвоста отримували для визначення гематокриту до того, як щурів вбили.

Вестерн-блот-аналіз.

Після гіпоксичного впливу експериментальних та контрольних щурів вбивали, а мозок швидко видаляли та заморожували у рідкому азоті. Коркові зразки розтинали та гомогенізували в крижаному буфері (20 мМ HEPES, рН 7,5, 1,5 мМ MgCl2, 0,2 мМ ЕДТА, 0,1 М NaCl), доповненому 0,2 мМ дитиотрейтолом, 0,5 мМ ванадатом натрію та інгібіторами протеази (0,4 мМ фенілметилсульфонілфториду і по 2 мкг/мл лейпептину, пепстатину та апротиніну). Згодом NaCl додавали до кінцевої концентрації 0,45 М і гомогенат центрифугували при 10000 g протягом 30 хв. Супернатанти збирали і змішували з рівним об'ємом буфера гомогенізації, що містив 40% (об./Об.) Гліцерину, перед тим як зберігати при -80 ° C. Зразки (загалом 200 мкг лізатів) піддавали електрофорезу в SDS-7% поліакриламідному гелі та переносили на нітроцелюлозні мембрани за стандартними процедурами.

Мембрани блокували 5% знежиреного сухого молока та інкубували протягом 2 годин при кімнатній температурі з наступними антитілами: моноклональний анти-HIF-1α (1: 500, Novus Biologicals, Littleton, CO), поліклональний анти-HIF-1β (1: 1000, Novus Biologicals) та поліклональний анти-VEGF (1: 400, Santa Cruz Biotech, Пало-Альто, Каліфорнія). Після цього відбулася інкубація з кон’югованими з пероксидазою хроном антитілами та посилене виявлення хемілюмінесценції (ECL, Amersham, Piscataway, NJ). Сирі ядерні екстракти клітин Hepa 1 (American Type Culture Collection, CRL-1830), що зазнали впливу 1% або 20% кисню, використовувались як позитивний контроль (30 мкг білка) при аналізі вестерн-блот. Концентрації білка визначали за допомогою протеїнового аналізу Бредфорда (Bio-Rad).

Вилучення РНК та аналіз нозерн-блот.

Загальну РНК виділяли з кори головного мозку за допомогою Системи ізоляції РНК-агентів (Promega, Madison, WI) відповідно до інструкцій виробника. Рівні зразки (10 мкг) загальної РНК електрофорезували в 1% агарозно-формальдегідних гелях, переносили на нейлонові мембрани (Millipore, Bedford, MA), ультрафіолетові зшиті і гібридизували із випадковими згаданими зондами. Плямки гібридизували з розчином Quickhyb (Stratagene, La Jolla, CA) і промивали 0,2 × сольовим розчином цитрату натрію, 0,1% SDS при 55 ° C. Зонди VEGF та GLUT-1 були придбані у Research Genetics (номери приєднання GenBank AA154722 та AA451073 відповідно), а олігонуклеотидний зонд для РНК 18S був отриманий від Life Technologies (Rockville, MD).

Імуногістохімія HIF-1α.

Нормоксичних та гіпоксичних щурів (4 та 21 день гіпоксії) глибоко знеболювали Нембуталом і перфузували внутрішньосерцево холодним фосфатно-забуференним фізіологічним розчином (pH 7,4), а потім 4% фосфатно-забуференним параформальдегідом. Мозок видаляли, постфіксували у 2% параформальдегіді протягом 24 годин і вкладали у парафін. Серійні зрізи (6 мкм) вирізали на мікротомі, встановили на предметних стеклах, покритих желатином, висушили на повітрі і зберігали при кімнатній температурі до обробки для імуногістохімії. Для ідентифікації деяких клітин, що експресують HIF-1α, проводили подвійне імуномаркірування за допомогою двох клітинних маркерів, нейронального ядерного антигену (NeuN) та гліального фібрилярного кислотного білка (GFAP). Коротко кажучи, зрізи депарафінізували, гідратували та піддавали вилученню антигену при 90 ° C протягом 25 хв з використанням розчину для отримання мішені (Dako, Carpinteria, CA), відповідно до інструкцій виробника. Моноклональне антитіло миші проти HIF-1α (1: 200, Novus Biologicals) було виявлено за допомогою системи стрептовідин-біотин-пероксидаза хрону (каталізована система посилення сигналу, Dako). Моноклональні анти-GFAP (1: 500, Sigma Chemical) та анти-NeuN (1: 500, Chemicon, Temecula, CA) були виявлені за допомогою вторинних антитіл, кон'югованих з техаським червоним та флуоресцеїном (Vector, Burlingame, CA).