Гіпертрофічна кардіоміопатія при ожирінні, спричиненому дієтою, роль придушення вилки
Анотація
Підсімейство Foxo факторів транскрипції forkhead, включаючи Foxo1 (FKHR), Foxo3a (FKHRL-1) та Foxo4 (AFX), є ціллю Akt (20). Фосфорилювання Akt призводить до ядерного виключення (інгібування) Foxo. На додаток до добре встановлених клітинних реакцій, викликаних Фоксо, включаючи диференціацію, метаболізм, проліферацію, виживання та атрофію скелетних м'язів (20, 37), цей фактор транскрипції також був показаний при атрофії кардіоміоцитів, що включає підвищення регуляції каскаду атрогенів (36, 37, 46). У скелетних м’язах атрогени контролюються фактором росту, опосередкованим Akt транскрипційною регуляцією факторів Фоксо (35, 37). Нещодавно було продемонстровано, що фактори транскрипції Фоксо експресуються в кардіоміоцитах під регуляцією факторів росту/сигналізації Akt. Foxo може контролювати програму транскрипції атрогену для регулювання розміру міоцитів за кількістю регуляторів серцевої гіпертрофії (40).
Дієтичне харчування з високим вмістом жиру та параметри сироватки.
Ехокардіографічна оцінка.
Геометрію та функції серця оцінювали у знеболених (Avertin 2,5%, 10 мкл/г тіла з масою в/в) мишей за допомогою двовимірної керованої М-ехокардіографії (Phillips Sonos 5500), оснащеної лінійним перетворювачем 15-6 МГц (Phillips Medical Systems, Андовер, доктор медицини). Товщини передньої та задньої стінок та діастолічний та систолічний розміри лівого шлуночка були записані з М-зображень за допомогою методу, прийнятого Американським товариством ехокардіографії. Фракційне вкорочення обчислювали за кінцевим діастолічним діаметром (EDD) та кінцевим систолічним діаметром (ESD), використовуючи рівняння (EDD-ESD)/EDD. Розрахункову ехокардіографічну масу лівого шлуночка (ЛШ) розраховували як [(LVEDD + товщина стінки перегородки + товщина задньої стінки) 3 - LVEDD 3] × 1,055, де 1,055 (мг/мм 3) - щільність міокарда. Частота серцевих скорочень усереднювалась за 10 серцевих циклів (14).
Виділення кардіоміоцитів.
Після седації кетаміну/ксилазину серця видаляли і перфузували бікарбонатним буфером Кребса-Генселейта, що містив (у мМ): 118 NaCl, 4,7 KCl, 1,2 MgSO4, 1,2 KH2PO4, 25 NaHCO3, 10 HEPES та 11,1 глюкози. Серця перетравлювали колагеназою D протягом 20 хв. Ліві шлуночки були видалені та подрібнені перед фільтруванням. Вихід міоцитів становив ~ 75%, на що дієтичне годування з високим вмістом жиру не впливало. Для механічного та внутрішньоклітинного дослідження Ca 2+ були відібрані лише паличкоподібні міоцити з чіткими краями (12).
Вкорочення та подовження клітин.
Механічні властивості кардіоміоцитів оцінювали за допомогою системи м'яких країв IonOptix (IonOptix, Milton, MA). Міоцити поміщали в камеру, встановлену на сцені мікроскопа Olympus IX-70, і суперконфузували (~ 2 мл/хв при 25 ° C) з гідрокарбонатним буфером Кребса-Генселейта, що містить 1 мМ CaCl2. Міоцити стимуляції поля проводили при 0,5 Гц, якщо не зазначено інше. Оцінювали вкорочення та подовження клітин, включаючи пікове вкорочення (PS) - пікове скорочення; час до PS (TPS) - тривалість скорочення; відновлення часу до 90% (TR90) - тривалість релаксації; і максимальні швидкості укорочення/подовження (± dL/dт) - і максимальний розвиток і зниження тиску (12).
Внутрішньоклітинні перехідні процеси Ca 2+.
Когорту міоцитів завантажували фурою 2-АМ (0,5 мкМ) протягом 10 хв, а інтенсивність флуоресценції реєстрували за допомогою системи флуоресценції з подвійним збудженням (Ionoptix). Міоцити поміщали на інвертований мікроскоп Olympus IX-70 і знімали через масляну об'єктив Fluor × 40. Клітини піддавалися впливу світла, випромінюваного 75-ваттною лампою, і пропускали через фільтр 360 або 380 нм, стимулюючи стискатися при 0,5 Гц. Випромінювання флуоресценції було виявлено між 480–520 нм, а якісна зміна інтенсивності флуоресценції фура 2 (FFI) визначалась із співвідношення FFI на двох довжинах хвиль (360/380). Час розпаду флуоресценції (одноразовий або двоекспоненціальний розпад) розраховували як показник внутрішньоклітинного очищення Ca 2+ (12).
Аналіз каспази-3.
Активність каспази-3 визначали за опублікованою методикою (23). Коротко, 1 мл PBS додавали до колби, що містить гомогенати тканини лівого шлуночка, перед центрифугуванням при 10000 g при 4 ° C протягом 10 хв. Надосадову рідину відкидали, а гомогенати лізували в 100 мкл крижаного буфера для лізису клітин (50 мМ HEPES pH 7,4, 0,1% CHAPS, 1 мМ DTT, 0,1 мМ EDTA та 0,1% NP-40). Аналіз проводили в 96-лунковому планшеті, кожна лунка містить 30 мкл клітинного лізату, 70 мкл аналітичного буфера (50 мМ HEPES, 0,1% CHAPS, 100 мМ NaCl, 10 мМ DTT і 1 мМ EDTA) і 20 мкл колориметричного субстрату каспази-3 Ac-DEVD-pNA (Sigma). 96-лунковий планшет інкубували при 37 ° C протягом 1 години, протягом цього часу каспазі у зразку дозволяли відщеплювати хромофор p-NA від молекули субстрату. Поглинання було виявлено при 405 нм з активністю каспази-3, пропорційною кольоровій реакції. Вміст білка визначали методом Бредфорда. Активність каспази-3 виражалася у вигляді пікомолей рНК, що виділяється на мікрограми білка за хвилину.
Аналіз каспази-3/7.
Активність каспази-3 та каспази-7 визначали, використовуючи набір для аналізу гомогенної каспази-3/7 Apo-ONE (Promega, Madison, WI). Каспаза-3 та каспаза-7 є членами сімейства специфічної протеази (каспази) цистеїну аспарагінової кислоти, які відіграють ключову роль в апоптозі в клітинах ссавців. Коротше кажучи, активність каспази-3 та каспази-7 була виявлена в клітинах, які зазнали апоптозу шляхом розщеплення родаміну 110, біс--Субстрат аміду CBZ- l-аспартил-l-глутаміл-l-валіл-l-аспарагінової кислоти (Z-DEVD-R110), який існує до проби як профлуоресцентний субстрат. Для проведення аналізу Apo-ONE каспази-3/7 ми змішали і додали буфер каспази-3/7 та субстрат Z-DEVD-R110 до гомогенатів тканини лівого шлуночка. Після послідовного розщеплення та видалення пептидів DEVD за допомогою активності каспази-3 та каспази-7, вихідна група R110 стане інтенсивно флуоресцентною при довжині хвилі збудження 499 нм та довжині хвилі випромінювання 521 нм. Активність каспази-3 та каспази-7 була прямо пропорційна флуоресценції R110 і виражалася як чиста флуоресценція (2).
Ex vivo домінантно-негативна трансфекція Foxo3a та Вестерн-блот-аналіз.
Загальна екстракція РНК, синтез кДНК, зворотна транскрипція та ПЛР у реальному часі.
Аналіз даних.
Дані є середніми ± SE. Статистичне порівняння проводили ANOVA з подальшими тестами Newman-Keuls post hoc. Значимість була встановлена як
Рис. 1.Вплив дієтичного харчування, що харчується, на апоптоз у лівих шлуночках мишей від груп з обмеженим вмістом жиру, з високим вмістом жиру та з високим вмістом жиру (контроль ваги). A: активність каспази-3. : активність капсази-3/7. Дані є середніми ± SE; = 5–6 мишей на групу. *
Таблиця 1. Біометричні та ехокардіографічні параметри мишей, яких годували з низьким або високим вмістом жиру протягом 6 місяців
Контроль за вагою - це обмеження дієтичного харчування з високим вмістом жиру. EDD, кінцевий діастолічний діаметр; ESD, кінцево-систолічний діаметр; ЛШ, лівий шлуночок. Дані є середніми ± SE; = ні. тварин.
* † 2+ властивості.
Ожиріння, спричинене дієтами з високим вмістом жиру, супроводжувалося значно збільшеною площею перерізу кардіоміоцитів, зменшеною ± dL/dт, і тривалий TPS та TR90 з нормальним PS (рис. 2), дещо нагадує наші попередні знахідки (33). Крім того, кардіоміоцити мишей з ожирінням, що годувались жиром, демонстрували значно підвищений вихідний рівень внутрішньоклітинного Са 2+, пригнічений внутрішньоклітинний підйом Са 2+ у відповідь на електричний стимул (ΔFFI) та зниження швидкості розпаду внутрішньоклітинного Са 2+ (одноразового або двоекспоненційного підгонка кривої; рис. 3). Ці механічні та внутрішньоклітинні дефекти Ca 2+ кардіоміоцитів, пов’язані з ожирінням, спричиненим дієтою, з високим вмістом жиру, значно пом’якшувались за допомогою маневру контролю ваги. Тим не менше, обмеження їжі з високим вмістом жиру злегка, але значно подовжує TR90 і двоекспоненціальне внутрішньоклітинне розпаду Ca 2+, не впливаючи на будь-які інші показники (рис. 2F та 3D).