Метаболічна інженерія лактатдегідрогенази рятує мишей від ацидозу Наукові звіти
Предмети
Анотація
Ацидоз спричиняє мільйони смертей щороку, і стратегії нормалізації рН крові у хворих на ацидоз дуже потрібні. Шлях лактатдегідрогенази (ЛДГ) має великий потенціал для лікування ацидозу завдяки своїй здатності перетворювати протони та піруват у лактат і тим самим підвищувати рН крові, але складно перерости у терапію, оскільки не існує підходів на основі фармацевтичної інженерії метаболізму шляхи in vivo. У цьому звіті ми демонструємо, що метаболічний потік шляху LDH може бути сконструйований із з'єднанням 5-аміно-2-гідроксиметилфенілборної кислоти (ABA), яка зв'язує лактат і прискорює споживання протонів шляхом перетворення пірувату в лактат і збільшення НАД Відношення +/NADH. Тут ми демонструємо, що ABA може врятувати мишей від індукованого метформіном ацидозу, зв’язуючи лактат і збільшуючи рН крові з 6,7 до 7,2 та співвідношення NAD +/NADH у крові в 5 разів. ABA - це перший клас молекул, який може метаболічно інженерно розвивати шлях LDH і може мати значний вплив на медицину, враховуючи велику кількість пацієнтів, які страждають на ацидоз.
Вступ
Рівень смертності від ацидозу серед критично хворих становить 50%. Ацидоз спричинений дисфункцією мітохондрій при виробленні АТФ, що призводить до накопичення протонів 1. Сучасна терапія молочнокислого ацидозу - лікування бікарбонатом, яке є неефективним через численні токсичні побічні ефекти, такі як зміна артеріального тиску, активація апоптозу та зміна рівня внутрішньоклітинного рН 2,3,4,5. Дихлорацетат є потенційним засобом лікування ацидозу, який посилює активність піруватдегідрогенази та блокує вироблення лактату, проте він також не ефективний, оскільки спричиняє нейропатію 6. Тому існує велика потреба у розробці стратегій, які можуть підвищити рН крові у пацієнтів, які страждають на ацидоз 6,7,8,9 .
У цьому звіті ми представляємо нову стратегію лікування ацидозу на основі сполуки ABA, яка пов'язує лактат і нормалізує рН крові за рахунок збільшення споживання протонів шляхом LDH. Механізм, за допомогою якого ABA лікує ацидоз, показаний на малюнку 1. ABA утворює двовалентний комплекс з лактатом і тим самим зменшує внутрішньоклітинну концентрацію лактату, зміщуючи рівновагу у бік виробництва більшої кількості лактату, що призводить до споживання протонів шляхом гідрування пірувату. Важливо, що АБК є специфічним для лактату в порівнянні з іншими метаболітами, такими як глюкоза, через його орто-гідроксил, який перешкоджає зв’язуванню цис-діолів 10. Крім того, ABA також збільшує співвідношення NAD +/NADH, що також має численні терапевтичні ефекти, такі як захист від апоптозу та придушення запалення.
5-аміно-2-гідроксиметилфенілборна кислота (ABA) метаболічно формує шлях лактатдегідрогенази і є терапією для лактоацидозу.
ABA пов'язує лактат і нормалізує рН крові, зміщуючи рівновагу шляху LDH у бік споживання протонів (показано червоним), пірувату та генерації NAD + .
Результати
ABA було визначено як терапевтичний засіб для лікування ацидозу через його потенційну здатність зв’язувати лактат. Тому ми провели експерименти, щоб визначити, чи утворює ABA стійкий комплекс з лактатом. Комплекс ABA-лактат утворився змішуванням 100 мкмолей ABA і лактату в 1 мл метанолу протягом 10 хв. Потім ABA-лактатний комплекс виділяли за допомогою препаративної ТШХ, в етилацетаті та проводили мас-спектрометрію ESI на ізольованому ABA-лактатному комплексі. Отримано експериментальну молекулярну масу 220,0786, яка корелювала з прогнозованим m/z 220,0786 і, отже, припускає, що ABA утворює стійкий комплекс з лактатом.
Ми також досліджували, чи може ABA зв’язувати лактат у присутності інших метаболітів, присутніх у сироватці крові, за допомогою ядерно-магнітного резонансу бору (ЯМР). ABA та L-лактат натрію додавали до 500 мкл 10% фетальної бичачої сироватки в модифікованому середовищі орела Дульбекко (DMEM) та аналізували за допомогою ЯМР бору. Малюнок 2B демонструє, що ABA пов'язує лактат у присутності метаболітів, що містяться у бичачій сироватці плода та DMEM. Наприклад, ароматичний бор ABA в сироватці має пік ЯМР при δ = 29, і він зміщується до δ = 9 у присутності лактату та сироватки, демонструючи специфічне комплексоутворення з лактатом. Зсуви піків, отримані в результаті цих експериментів, корелювали із зсувами піків, отриманими від ЯМР бору синтетичного стандарту ABA-лактату (виділеного за допомогою препаративної ТШХ). Ці дані демонструють, що ABA специфічно комплексує з лактатом і не зв'язує жоден з метаболітів, які зазвичай містяться в сироватці крові та DMEM 10 .
ABA пов'язує лактат, збільшує співвідношення NAD +/NADH та споживання пірувату.
(A) ЯМР бору виділеного комплексу ABA-лактату. Вільний ABA має пік бору при δ = 29 (синій пік), який зсувається до δ = 9 для ABA-лактатного комплексу (червоний пік). (B) ABA пов'язує лактат натрію у присутності 10% сироватки, як визначено за допомогою ЯМР бору. Вільний ABA в сироватці має пік бору при δ = 29 (синій пік), який зсувається до δ = 9 у присутності еквімолярного лактату (червоний пік). (C) ABA збільшує співвідношення NAD +/NADH у два рази в клітинах RAW 264,7. Клітини інкубували з 0,1 М PBS або 5 мМ ABA протягом 5 хв, збирали клітинні лізати та вимірювали співвідношення NAD +/NADH у клітинних лізатах. (D) ABA знижує рівень пірувату в два рази в клітинах RAW 264,7. Клітини інкубували з 0,1 М PBS або 5 мМ ABA протягом 5 хв, збирали клітинні лізати та вимірювали рівні пірувату в клітинних лізатах.
Щоб ABA ефективно метаболічно розробляв шлях LDH, він повинен потрапляти в клітини. Тому ми вимірювали Log D ABA, використовуючи вимірювання поглинання при 330 нм в аналізі розподілу октанол/вода. ABA має Log D 0,80 ± 0,03, що свідчить про те, що ABA має бути проникною для клітинної мембрани. Здатність ABA посилювати споживання пірувату та NADH досліджували в клітинах RAW 264,7. 10 6 клітин RAW 264,7 інкубували з 5 мМ ABA протягом 5 хв, і клітини лізували, гомогенізували та відокремлювали від білків для аналізу вмісту пірувату, NAD + та NADH. Рисунок 2C демонструє, що ABA збільшує співвідношення NAD +/NADH удвічі, а малюнок 2D демонструє, що рівні пірувату знижуються в 2 рази, тим самим припускаючи, що ABA може каталізувати детоксикацію протонів.
ABA призначений для зниження рівня лактату під час ацидозу шляхом зв'язування лактату і тим самим спрямовуючи метаболічний шлях ЛДГ на споживання надлишку протонів. Тому ми дослідили, чи може ABA зв’язувати лактат in vivo та зменшувати його концентрацію в крові. 11 мкмолей ABA у 100 мкл фізіологічного розчину вводили мишам через хвостову вену і через 10 хв їх кров аналізували на вміст лактату та порівнювали з контролем. Фігура 3А демонструє, що ABA може знижувати рівень лактату в крові, наприклад, рівень лактату в крові у здорових мишей становив 2 ± 0,5 мМ, однак у мишей, які отримували ABA, рівень лактату в крові зменшився в 3 рази і був знижений до 500 ± 200 мкМ . ABA може знизити рівень позаклітинного лактату в три рази протягом 10 хв. Цей швидкий ефект є важливим для лікування ацидозу через швидкі часові рамки, коли підвищений рівень протону в крові спричинює смерть. Важливо, що при цій дозі ABA не спричиняла втрати ваги у мишей протягом трьох днів, і ми не спостерігали змін у рівні лактату/пірувату мозку, рівні NAD +/NADH або рН крові (цифри 3B, 4C).