Ожиріння посилює запалення та погіршує лімфатичну функцію на мишачій моделі лімфедеми

Відділ пластичної та реконструктивної хірургії, відділення хірургії, Меморіальний центр раку Слоун Кеттерінг, Нью-Йорк, Нью-Йорк

Адреса для запитів на передрук та іншої кореспонденції: B. J. Mehrara, Weill Cornell Univ. Медичний центр, пр. Йорк, 1275, Suite MRI 1006, Нью-Йорк, Нью-Йорк 10065 (електронна пошта: [електронна пошта захищена]).

Анотація

У цьому дослідженні ми проаналізували вплив ожиріння, спричиненого дієтою (DIO), на лімфатичну фізіологію та розвиток лімфедеми за допомогою моделі миші. Тут ми показуємо, що дорослі самці мишей C57BL/6J, які харчуються дієтою з високим вмістом жиру, страждають ожирінням і розвивають знижену пропускну здатність лімфатичної рідини на початковому рівні порівняно з худими одноколесниками, які харчуються звичайною дієтою чау. Що ще важливіше, ми показуємо, що миші з ожирінням мають більш важкий фенотип лімфедеми хвоста з підвищеним жировим відкладенням, фіброзом та запаленням. Цікаво, що за допомогою моделі місцевого подразнення ми виявили, що миші з ожирінням мають значно підвищену схильність до запалення тканин порівняно з худими мишами, із помітно збільшеною інфільтрацією макрофагів та нейтрофілів. Взяті разом, наші результати дозволяють припустити, що ожиріння зменшує лімфатичну функцію і збільшує схильність до запалення на початковому рівні, і що ці ефекти посилюються при ураженні лімфи, що призводить до більш важкого фенотипу лімфедеми.

Всі експериментальні протоколи були розглянуті та схвалені Інституційним комітетом з догляду та використання тварин при онкологічному центрі Меморіал Слоун Кеттерінг. Самців мишей C57BL/6J купували у лабораторіях Джексона (Бар-Харбор, штат Мексика) та утримували в середовищі з контролем температури та світла. Для встановлення ДІО дорослих мишей-самців підтримували дієту з високим вмістом жиру (60% ккал від жиру, W.F Fisher & Son), починаючи з віку 6 тижнів за бажанням протягом 8–10 тижнів. Контрольовані за віком самці мишей дикого типу підтримувались на нормальній дієті чау (13% ккал від жиру; Дієта гризунів Purina PicoLab 20, W.F Fisher & Son) протягом того ж періоду часу (19, 29). На завершення експерименту тварин зважували за допомогою цифрових ваг (Sartorius, Bradford, MA).

Модель хвоста миші лімфедеми.

Ожирілі та худорляві контрольні тварини зазнали лімфатичної травми, використовуючи добре описану модель лімфедеми мишачого хвоста, в якій поверхневу та глибоку лімфатичну систему хвоста вирізали через 2-міліметрову окружну вирізку шкіри в середній частині хвоста (5, 9, 23, 26). Наша група та інші раніше показали, що ця модель призводить до стійкої лімфедеми дистального відділу хвоста, серйозного порушення лімфатичної функції та гістологічних особливостей клінічної лімфедеми (наприклад, хронічне запалення, відкладення жиру та фіброз) протягом принаймні 10 тижнів після операції ( 5, 9, 23, 26). Окремий набір ожирілих і худорлявих тварин ( = 8–10 тварин/група) не проводили хірургічного втручання на хвості і служили нашим базовим контролем. Тварин евтаназували 6 тижнів після операції та аналізували, як зазначено нижче.

Обсяги хвоста, лімфосцинтиграфія та гістологічний аналіз.

Розрахунки обсягу хвоста аналізували за допомогою кількох вимірювань окружності хвоста цифровим штангенциркулем дистальніше зони лімфатичної травми та формули усіченого конуса, як описано раніше (9). Лімфосцинтиграфію також проводили, як було описано раніше, для кількісної оцінки лімфатичного потоку в крижові лімфатичні вузли шляхом введення 50 мкл відфільтрованого колоїду сірки технецію (99 мкг) в дистальний хвіст (6). Поглинання з урахуванням розпаду реєстрували в крижових лімфатичних вузлах за допомогою камери X-SPECT (Gamma Medica, Northridge, CA), а аналіз області, що представляє інтерес, проводили за допомогою програмного забезпечення ASIPro (CTI Molecular Imaging, Knoxville, TN) (9).

Для гістологічного та імуногістохімічного аналізу збирали хвостові зрізи, коротко фіксували у 4% крижаному параформальдегіді (Sigma-Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі), декальциновували за допомогою 5% EDTA (Santa Cruz Biotechnology, Санта-Крус, Каліфорнія) протягом 72 год., та вбудований парафін. Черевні зрізи збирали у ожирілих та контрольних мишей за допомогою 5-міліметрових наборів для біопсії (Fray Products, Буффало, Нью-Йорк), закріплених у 4% параформальдегіді (Affymetrix, Cleveland, OH), а згодом вбудованому парафіну. Зрізи, пофарбовані гематоксиліном та еозином, готували із застосуванням стандартних методик, а аналіз товщини підшкірної клітковини проводили в гістологічних поперечних зрізах, розташованих на відстані 1,5 см від місця операції, сліпими рецензентами ( = 6–8 перерізів/група). Відстань від базального шару епідермісу до глибокої фасції аналізували в 4 стандартизованих областях/розділі.

Імуногістохімічне фарбування проводили за нашими встановленими методиками (5). Тканини, вкладені в парафін, короткочасно регідратували, і викриття антигенів проводили за допомогою киплячого цитрату натрію (Sigma-Aldrich). Ендогенну пероксидазну активність гасили, а неспецифічне зв'язування блокували 2% BSA-20% сироватки тварин. Тканини інкубували з первинними антитілами протягом ночі при 4 ° С, а фарбування антитіл візуалізували з використанням вторинних антитіл, кон’югованих з пероксидазою хрону, розроблених комплексом діамінобензаміну (Vector, Burlingame, CA). Первинні антитіла, що використовуються для імуногістохімічних плям, включали ендотеліальний рецептор гіалуронану лімфатичних судин (LYVE) -1, CD45 та CD4 (усі з R&D, Міннеаполіс, Міннесота). Всі вторинні антитіла були отримані від Vector Laboratories. Зрізи аналізували за допомогою мікроскопії з яскравим полем, а області, що цікавили, сканували за допомогою діагностичного сканера Mirax (Zeiss, Мюнхен, Німеччина). Двома засліпленими рецензентами проводили підрахунок клітин на високопотужних зрізах із мінімум 4–6 тварин/група та 4–5 потужних полів (HPF)/тварину.

Фіброз оцінювали за допомогою наших раніше опублікованих методів для кількісної оцінки фарбування червоним красною Сіріус (Polysciences, Warrington, PA) та імуногістохімії I типу колагену (4). Коротко, індекс червоного шраму Сіріуса був розрахований за допомогою мікроскопії поляризованого світла для визначення співвідношення двома лучепреломлення помаранчевого/червоного до жовтого/зеленого та проаналізований за допомогою програмного забезпечення Metamorph Offline. Імуногістохімію колагену I типу проводили з використанням антитіла до мишачого колагену I типу (Abcam, Cambridge, MA) і визначали як відношення площі позитивно забарвленої дерми в межах фіксованого порогу до загальної площі тканини.