Підвищена транскрипція гена QSOX1, що кодує Quiescin Q6 сульфгідрилоксидазу 1 при раку молочної залози

Партнерська школа біологічних наук, Центр біомедичних наук, Лондонський університет Королівського Холлоуей, Лондон, Великобританія

Партнерська школа біологічних наук, Центр біомедичних наук, Лондонський університет Королівського Холлоуея, Лондон, Великобританія

Михайло Соловйов,
Мішель П. Естевес,
Фахрія Амірі,
Марк Р. Кромптон,
Крістофер С. Вершник

Цифри

Анотація

Цитування: Соловйов М, Естевес М.П., Амірі F, Кромптон МР, Rider CC (2013) Підвищена транскрипція гена QSOX1, що кодує Квієсцин Q6 сульфгідрилоксидазу 1 при раку молочної залози. PLoS ONE 8 (2): e57327. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0057327

Редактор: Джун Лі, медична школа університету Сунь Ятсен, Китай

Отримано: 16 вересня 2012 р .; Прийнято: 21 січня 2013 р .; Опубліковано: 27 лютого 2013 р

Фінансування: Автори не мають підтримки чи фінансування для звітування.

Конкуруючі інтереси: Автори заявили, що не існує конкуруючих інтересів.

Вступ

Добре встановлено, що рука хромосоми 1q підлягає ампліфікації на рівні ДНК приблизно у 50–60% випадків раку молочної залози [1] - [3]. Незважаючи на те, що це не єдина ампліфікація хромосом при цьому захворюванні, вона є однією з найбільших і найпоширеніших, і її трактують як ранню подію канцерогенезу молочної залози [1]. Оцінки розміру та кількості задіяних окремих ампліконів різняться, але нещодавніші порівняльні дослідження геномної гібридизації з високою роздільною здатністю показали, що, хоча весь q-рукав може бути посилений, області 1q21.1–1q31.1 та 1q32.1–1q44 є найбільш часто постраждалі [4], [5]. На відміну від 1q, рука 1p демонструє незначне посилення, часто втрачаючи номер копії [1], [3] - [5]. Однак функціональне значення ампліфікації гена 1q залишається невідомим. Як і слід було очікувати, кількість копій генів пов'язана з надмірною експресією мРНК в тканині раку молочної залози, але кореляція тут менш повна. Дослідження мікрочастин кДНК показало, що 44% високоампліфікованих генів сильно гіперекспресовані при раку молочної залози, але так само 6% генів при нормальній кількості копій [6].

Оскільки ціле плече 1q підлягає ампліфікації генів, ми припустили, що картографування багатьох генів у цій геномній області є важливим для пухлинного раку молочної залози та/або прогресування. Однак на сьогоднішній день ми знаємо, що лише два гени 1q, COX2 [7], [8] та пероксиредоксин-6/PRDX6 [9], виявились надмірно вираженими при раку молочної залози і відігравали ключову роль у метастазуванні та виживанні ракових клітин. . Подальший ген 1q, нектин-4/PVRL4, як відомо, надмірно експресується, проте патологічне значення цього поки що незрозуміле [10]. Для того, щоб дослідити, чи можуть бути надмірно експресовані додаткові гени 1q при раку молочної залози, ми проаналізували їх рівень мРНК у нормальній та раковій тканині молочної залози, використовуючи серійний аналіз експресії генів (SAGE) та даних EST, зібраних у Проекті анатомії геному раку (http: // cgap.nci.nih.gov). Результати цих аналізів виявляють, що кілька генів демонструють особливо високий рівень надмірної експресії, включаючи QSOX1 (NM_002826), який кодує фермент квієцин Q6 сульфгідрил-оксидазу 1. Цей фермент належить до сімейства флавін-аденинінуклеотидів (FAD) - залежних сульфгідрил-оксидаз [11].

Ми підтвердили свої результати біоінформатики для QSOX1 експериментально, шляхом проведення RT-PCR, 3′RACE PCR та кількісної ПЛР у реальному часі. Ми виявили нову розширену 3'UTR-форму транскрипту QSOX1 і показали, що ген справді надмірно експресується при раку молочної залози з поганим прогнозом. Наші дані визначають QSOX1 як ген, вартий подальшого детального дослідження, щоб визначити його значимість у патогенезі та прогресуванні цієї хвороби.

Результати

Надмірне вираження та 3 ′ розширення стенограм QSOX 1 при раку молочної залози

Для того, щоб дослідити, чи часта ампліфікація генів q плеча хромосоми 1 може бути пов'язана з надмірною експресією генів, розташованих у цій області, ми дослідили пару відповідних бібліотек SAGE за допомогою інструменту DGED. Дані SAGE показали, що 156 генів гена 1q піддаються транскрипційній регуляції в протоці карциноми молочної залози порівняно з нормальною тканиною молочної залози. Збільшення регуляції приблизно однієї третини цих генів було визнано значним (P≤0,05), а 25 з цих генів демонструють надзвичайно значну підвищену регуляцію (P≤0,01). Останні надрегульовані гени наведені в таблиці 1 в порядку найвищого ступеня їх надмірної експресії при раку молочної залози; гени з (0,01

Панель A показує ампліфіковану кДНК з використанням праймерів 45-F і 46-R (очікувана довжина 550 п.н.). Панель показує ампліфіковану кДНК з використанням праймерів 43-F і 44-R (очікувана довжина 735 bp). Інші ампліфікації ПЛР використовували праймери: 63-F з 64-R (панель C., очікуваний розмір 836 bp), 47-F з 48-R (панель D, очікуваний розмір 922 bp), 49-F з 50-R (панель Е, 825 bp), 53-F з 36-R (панель F, 883 bp), 23-F з 54-R (панель G, 620 п.н.). Панель H показана ампліфікована кДНК розчинної версії QSOX1 (QSOX1b) з використанням праймерів 17-F та 18-R (очікувана довжина 814 bp). Панель Я показує розмір фрагмента кДНК, посилений специфічним сенсорним праймером (106-Int-F) та антисмисловим 3 ′ RACE-адаптером-праймером (Adap-1-R). Специфічність ампліфікації (ідентичність усіх ампліфікованих продуктів ПЛР) була додатково підтверджена секвенуванням ДНК для всіх ампліфікованих продуктів.

Для того, щоб ідентифікувати фактичний 3 ′ кінець розширеної кДНК QSOX1, ми провели 3′-RACE-PCR, використовуючи набір вкладених конкретних праймерів та набір 3′-RACE адаптерів-праймерів (див. Додаткову таблицю S2 для послідовностей). Ампліфікована кДНК була виявлена як смуга ∼300 bp, див. Малюнок 2, панель I, а 3'-кінець кДНК QSOX1 підтверджено секвенуванням. Кінець розширеної кДНК QSOX1 відповідає позиції 150651 геномної послідовності (AL390718), див. малюнок 1B. Ми також виявили типовий сигнал поліаденілювання AATAAA, розміщений приблизно в тридцяти нуклеотидах вище за послідовністю полі-А в кДНК (рис. 1В). Комбінація накладених RT-PCR, 3′-RACE-PCR та сигналу поліаденілювання однозначно підтвердила положення справжнього 3 ′ кінця кДНК QSOX1. Оскільки трансляція QSOX1 зупиняється всередині exon12, який містить стоп-кодон, то нещодавно ідентифіковане розширення є довгим некодуючим 3′UTR.

Кількісна ПЛР у реальному часі розшифровок транскриптів QSOX1 при раку молочної залози

Далі ми прагнули підтвердити експериментально як існування цього нового 3 ′ подовження мРНК QSOX1, так і підвищення рівня мРНК QSOX1 у тканині раку молочної залози. Отже, ПЛР у реальному часі проводили з використанням наборів зондів на основі кодуючої послідовності QSOX1 (CDS) (Набір 1) та на нещодавно ідентифікованому розширенні 3′UTR (Набори 2 та 3, див. Малюнок 1А). Була проведена скринінг групи зразків кДНК, підготовленої з хірургічно видаленої тканини молочної залози. Всі перевірені тканини виявили транскрипцію всіх трьох тестованих областей QSOX1, підтверджуючи, що мРНК QSOX1 існує у вигляді стенограми ∼6 кбіт, що набагато довше, ніж вважалося раніше. Експресія всіх трьох областей була низькою в нормальних тканинах та пухлинах 1 ступеня, але демонструвала підвищений рівень у зростаючій частці пухлин 2 та 3 ступеня, Малюнок 3A – C. Непараметричний статистичний аналіз за всіма чотирма клінічними класифікаціями показав коефіцієнт кореляції Спірмена 0,53 між відносним рівнем транскрипту та клінічною оцінкою, значення значне на рівні р 0,01. З 15 досліджених пухлин 3 ступеня експресія в 10 зразках перевищувала верхню межу норми (середнє +2 стандартні відхилення) для кожного набору праймерів.