Повна стаття Білки, гомологічні аквапоринам вищих рослин прісноводних водоростей Ulothrix

Оригінальні статті

Повна стаття
Цифри та дані
Список літератури
Цитати
Метрики
Передруки та дозволи
PDF
EPUB

Анотація

Вступ

Нитчаста зелена водорость Ulothrix zonata (Вебер та ін Мор) Кюц. (Ulotrichales, Ulvophyceae) - широко поширений вид, який, як правило, мешкає в зоні бризок та мілководді помірних озер. Вид, схоже, пристосований до холоду і, як правило, демонструє сезонні особливості зростання (Грем та ін., 1985 рік ). У Байкалі, U. zonata інтенсивно розвивається в березні – квітні на нижній поверхні крижаного покриву Байкалу за відносно стабільних температур, близьких до 0 ° С. Він зростає в достатку в період без льоду (травень – вересень) (Іжболдіна, 1990), а влітку утворює щільний покрив на камені біля краю води, де нитки піддаються значним добовим коливанням температури.

Опубліковано в Інтернеті:

Рис. 1–4. Зміни в середовищі існування та розмірах клітин Ulothrix zonata протягом різних сезонів. Рисунки 1, 2. Населення криги в березні. (Рис. 1) Крижана поверхня заростає U. zonata. (Рис. 2) Легко пігментовані нитки популяції льоду. Рис.3, 4. Популяція бентосних водоростей. (Рис. 3) Камені, зарослі U. zonata. (Рис. 4) Короткоклітинні, щільно пігментовані U. zonata нитки літньої популяції. Шкала шкал: Рис. 2 і 4, 100 мкм.

Рис. 1–4. Зміни середовища існування та розмірів клітин Ulothrix zonata протягом різних сезонів. Рисунки 1, 2. Населення криги в березні. (Рис. 1) Крижана поверхня заростає U. zonata. (Рис. 2) Легко пігментовані нитки популяції льоду. Рис.3, 4. Популяція бентосних водоростей. (Рис. 3) Камені, зарослі U. zonata. (Рис. 4) Короткоклітинні, щільно пігментовані U. zonata нитки літньої популяції. Шкала шкал: Рис. 2 і 4, 100 мкм.

Фізіологічна акліматизація та адаптація водоростей із прісноводних крижаних спільнот залишаються недостатньо вивченими. Раніше льодовикові та придонні популяції Росії U. zonata з Байкалу було показано, що вони відрізняються від морських Улотрикс види, маючи високий вміст поліненасичених жирних кислот (ФК) та сезонні коливання температури води, мали лише незначний вплив на їх загальну кількість (Осипова та ін., 2009). Активний контроль потоку води може мати вирішальне значення для адаптації до холодних температур, але деталі механізмів невідомі (Maurel та ін., 2008). Рух води через мембрани плазми та тонопласта опосередковується аквапоринами, причому різні представники цього сімейства генів специфічні для розвитку, стресу та клітинного розподілу. У літературі є ряд даних про важливу роль аквапоринів, що належать до сімейства PIP, у адаптації до низьких температур. Лікування холодом знижувало експресію більшості генів PIP у Арабідопсис (Jang та ін., 2004), а в листі пшениці спостерігалося значне підвищення рівня транскриптів PIP після холодної акліматизації (з 22ºC до 4ºC) (Герман та ін., 2006).

У цьому дослідженні ми були зацікавлені у виявленні аквапоринів, пов’язаних із власними білками плазматичної мембрани (PIP) з U. zonata, Озеро Байкал, і можливі сезонні коливання їх чисельності.

Матеріали і методи

Хімікати

Ponceau S, Tween-20, DTT, nBT, BCIP та SigmaMarker (широкий діапазон 6500–200 000 Da) були придбані у Sigma Inc. (Сент-Луїс, штат Міссурі). PMSF були отримані від Calbiochem (США); PVP від Biomedicals (Німеччина); нітроцелюлозні мембрани Hybond ECh від Amersham Biosciences (Великобританія); вторинні антитіла, кон'юговані з лужною фосфатазою від Promega (США). Первинними антисиворотками були антитіла проти AtTIP фірми Agrisera, Швеція (продукт AS09 493), що розпізнають C-кінцевий γ-TIP (TIP1) пептид INQNGHEQLPTTDY та кролячі анти-ZmPIP1 антитіла, спрямовані проти збереженого N-кінцевого пептиду ізоформ ZmPIP1GGPGPGPGPGPGPGPGPGPPPPPPGPGPGPGPGPGPGPGPGFGFGWDWWWWW, KGT, Мартінес-Баллеста та ін., 2008). Для контролю специфічності ми використовували блокування антисироватки з допомогою рекомбінантного злитого білка GST-ZmPIP1-N-кінця, який використовувався для підняття антитіл, і TIP1; 1, TIP1; 2 (внутрішній білок тонопласту), що блокує пептид від Agrisera (продукт AS09 493P) відповідно.

Рослинні матеріали

Ulothrix zonata був відібраний з нижньої поверхні крижаного покриву (товщиною 0,9–1 м) Байкалу в березні та квітні 2006 р. підводним плаванням та з каменів на березі води в липні 2006 р., липні та жовтні 2007 р. та 10 та 19 жовтня 2013 р. Усі зразки очищали від видимих домішок і транспортували до лабораторії в термостабільному контейнері протягом 1 години. Зразки сушили на фільтрувальному папері (Bio-Rad), а потім водорості заморожували в рідині N2 і зберігали при -70ºС до екстракції. Приблизно 96% зразків під льодом (березень та квітень 2006 р.), 95% зразків, зібраних у липні 2006 та 2007 рр., Та 97–99% зразків з жовтня 2007 та 2013 рр. Складались із U. zonata нитки з незначною кількістю епіфітних діатомових водоростей. Arabidopsis thaliana листя використовували як позитивний контроль.

Вимірювання розміру комірки

Вимірювали довжину та ширину 50 клітин, вибраних випадково з кожної популяції, під світловим мікроскопом «Peraval» (Carl Zeiss Jena, Німеччина) при збільшенні 800 ×. Для оцінки об'єму комірки (V) і поверхні (S) було обрано найближчу геометричну фігуру (тобто циліндр) та проведено розрахунки за формулами V = πr 2 l та S = 2πrl + 2πr 2, де r - радіус клітина, а l - довжина комірки.

Моніторинг температури води

Температуру постійно реєстрували з інтервалом у 1 год на місцях відбору проб за допомогою автономних програмованих датчиків (Stow Away TidBit Loggers, OnSet Corp., Cape Cod, Massachusetts), як на березі води, так і на глибині 3,6 м. Температуру води на краю води вимірювали ртутним термометром при негативних температурах повітря (наприклад, у жовтні 2007 р.).

Приготування білкових екстрактів

Заморожені водорості гомогенізували піском із високим діоксидом кремнію та буфером (pH 7,5), що містить 50 мМ трис-HCl, 5 мМ EDTA, 1 мМ PMSF, 2 мМ DTT, 0,1% PVP та 0,5 M сахарози у співвідношенні 1: 1 (w/v) протягом 20 хв. Гомогенат обробляли ультразвуком (40 кГц протягом 20 хв) і центрифугували при 10000 g протягом 20 хв, супернатантну фракцію центрифугували при 100000 g протягом 1 год в ультрацентрифузі (Sorvall Discovery 90SE, США). Отриману гранулу (мікросомні білки) ресуспендували в 5 мМ буфері Tris-НСl (рН 7,5), що містить 0,33 М сахарози та 2 мМ DTT. Мікросомальна фракція була взята з листя Арабідопсис і використовується для контролю вестерн-блот-аналізу. Всі процедури проводили при 4 ° C. Вміст білка визначали, як описано Бредфордом (1976), використовуючи сироватковий альбумін як еталон калібрування.

SDS-PAGE та Вестерн-блот-аналіз

Вилучення та секвенування ДНК

Опубліковано в Інтернеті:

Таблиця 1. Список Ulothrix zonata зразки з Байкалу та околиць, для яких були визначені послідовності ITS2 та часткові LSU рДНК.

Результати

Температура води в середовищі проживання Ulothrix zonata

Вимірювання температури води на береговій лінії показало помітні добові коливання: у липні 2006 року температура води змінилася з 5,5ºС вночі до 11ºС вдень; у липні 2007 року від 5ºС вночі до 15ºС вдень; У жовтні 2007 року температура води знизилася до 6–8ºС, а нічна температура повітря знизилася до −5ºС. У березні та квітні 2006 р. Температура води під льодом коливалася в межах 0,1–0,3ºС і суттєво не змінювалася. Температура води, виміряна 10 та 19 жовтня 2013 р., Становила 6–7ºС та 4,3ºС відповідно.