Простагландин D-синтаза ліпокалінового типу як ферментний ліпокалін - База даних біографії Мадам Кюрі

Книжкова полиця NCBI. Служба Національної медичної бібліотеки, Національних інститутів охорони здоров’я.

ліпокалінового

База даних біографії Мадам Кюрі [Інтернет]. Остін (Техас): Landes Bioscience; 2000-2013.

База даних біографії Мадам Кюрі [Інтернет].

Йосіхіро Ураде, Наомі Егучі та Осаму Хаяїші .

Автори

Приналежності

Вступ

Фігура 1

Біосинтетичний та метаболічний шлях PGD2. cPLA2: цитозольна фосфоліпаза А2; TXA2: тромбоксан А2.

Послідовність амінокислот та вторинні та третинні структури

КДНК для L-PGDS спочатку була виділена з бібліотеки кДНК 10 головного мозку щурів, а згодом з багатьох інших видів ссавців, включаючи людину 11 та мишу, 12, а також з 2 земноводних. 13, 14 КДНК для L-PGDS кодує білок, що складається із 189 та 190 амінокислотних залишків у мишачому та людському ферментах відповідно. На малюнку 2 показано вирівнювання послідовностей ферментів людини та миші. L-PGDS посттрансляційно модифікується розщепленням N-кінцевого гідрофобного сигнального пептиду, що включає 24 та 22 амінокислотні залишки в мишачому та людському ферментах відповідно. Два місця N-глікозилювання в положеннях Asn51 та Asn78 ферментів миші та людини 10 зберігаються у всіх ідентифікованих на сьогодні ферментах ссавців, але в гомологах земноводних вони не виявлені. L-PGDS ссавців сильно глікозильований 2-ма ланцюгами цукрового N-глікозильованого, кожен з молекулярною масою 3000. Вуглеводну структуру L-PGDS визначали у зразках, очищених від ліквору людини (СМЖ), 15 сироватки крові, 16 сечі 16, 17 та навколоплідних вод. 17 Однак функціональне значення цукрових ланцюгів ще належить визначити.

Малюнок 2

Вирівнювання послідовності L-PGDS людини та миші. Місце розщеплення сигнальної послідовності (стрілки), залишок каталітичного цистеїну (зірка), цистин (відкриті кола) та 2 місця глікозилювання (закриті кола) L-PGDS показані у верхній частині послідовності. Позиції (докладніше.)

Хімічні та структурні властивості білка L-PGDS були проаналізовані з використанням гетерологічно експресованого в E. coli або дріжджах рекомбінантного білка. L-PGDS є дуже стабільним ферментом і має високу стійкість проти термічної обробки 1 та перетравлення протеази. 18 Наприклад, понад 50% активності зберігалося після нагрівання ферменту протягом 5 хв при 100 ° С та лужному рН. 1 L-PGDS майже повністю повторно склали шляхом розведення та охолодження ферменту, денатурованого 1% SDS при 100 ° С протягом 10 хв, або 6 М гуанідину гідрохлоридом. 19 Таким чином, L-PGDS є цікавим білком для вивчення переформування білка.

Кругова дихроїстична спектроскопія рекомбінантного щурячого L-PGDS показала, що фермент складається в основному з β-ланцюгів, 19 подібних до інших ліпокалінів. Ми вже кристалізували рекомбінантну мишу L-PGDS. 6, 9 Однак якість даних рентгенівської дифракції, отриманих із спочатку приготованих кристалів, була недостатньою для визначення надійних координат L-PGDS. Зовсім недавно, модифікуючи умови кристалізації та використовуючи мутант селенометионілу Cys65Ala, 20 ми успішно визначили рентгенівську кристалографічну структуру L-PGDS з 2 різними конформерами відкритої та закритої чашечок з роздільною здатністю 2,1Å (Kumasaka T, Irikura D, Ago H, Aritake K, Yamamoto M, Miyano M, YU і OH, неопубліковані результати). Рентгенокристалографічний аналіз показав, що L-PGDS має типову ліпокалінову складчасту структуру β-стовбура. Однак L-PGDS містить 2 гідрофобні кишені; один - каталітичний сайт, що відповідає ліганд-зв'язуючому кишені інших ліпокалінів, а інший - ліпофільний сайт, що зв'язує ліганд, розташований на стороні молекули L-PGDS, протилежній тій, що містить сайт, що зв'язує ретиноїди.

Властивості, що зв'язують ліганд

Подібно до інших ліпокалінів, L-PGDS пов'язує ретиноїди, 21 білірубін та білівердин 22 з високим спорідненістю (Kd = 30-80 нМ). Відстежуючи загасання внутрішньої флуоресценції триптофану L-PGDS та круговою дихроїстичною спектроскопією зв’язаних лігандів, ми показали, що L-PGDS пов'язує повністю транс- або 9-цис-ретиноеву кислоту та цілком транс- або 13-цис -ретинальдегід, але не повністю транс-ретинол, при мольному співвідношенні 1: 1 з Kd від 70 до 80 нМ. 21 Спорідненість L-PGDS до ретиноїдів порівнянна або трохи вища, ніж до інших ліпокалінів, що діють як позаклітинні транспортери ретиноїдів, таких як β-лактоглобулін, плазмозв’язувальний білок ретинолу та плазмозв’язувальний білок ретиноевої кислоти (розглянуто в інших главах ). L-PGDS також пов'язує гормон щитовидної залози з Kd 0,7-2 мкМ та білівердин та білірубін з високим спорідненістю, тобто з Kd 30-40 нМ. 22 Нещодавно ми виявили, що L-PGDS пов'язує свій продукт PGD2 з високою спорідненістю (Kd 20 нМ; Aritake K, YU; неопубліковані результати), припускаючи, що L-PGDS діє не тільки як фермент, що продукує PGD2, але і як позаклітинний транспортер PGD2 для запобігання його метаболізму та неферментативної дегідратації.

Серед цих несубстратних гідрофобних лігандів ретиноїди, 21 білірубін та білівердин 22 пригнічували активність PGDS неконкурентно. Однак їхні інгібуючі потенції були надзвичайно слабкими (IC50 = 4˜10 мкМ), на відміну від їх високого спорідненості (Kd = 30-80 нМ) зв’язування з L-PGDS, як оцінювали шляхом гасіння внутрішньої флуоресценції триптофану. Отже, каталітичний сайт та сайт зв'язування для цих гідрофобних лігандів вважаються різними один від одного. З іншого боку, ми передбачали, що PGD2 прив'язаний до каталітичної кишені. Дві чіткі кишені для зв’язування були нарешті визначені кристалографічним дослідженням мишачого L-PGDS, як описано вище.

Тому ми вважаємо, що L-PGDS є багатофункціональним білком; він діє як фермент, що продукує PGD2, поєднуючись з циклооксигеназою-1 або -2, ферментами, що перебувають в каскаді PG, всередині клітин, а також функціонує як ліпофільний білок, що зв'язує ліганд, після секреції в позаклітинні простори та різні тіла рідини. Як описано в наступному абзаці, PGD2 менш хімічно стабільний, ніж PGE2 або PGF2α, дегідруючи до серії PG J. Після прив’язки до L-PGDS PGD2 надзвичайно стабілізується, щоб уповільнити перетворення на PG серії J. Більше того, спорідненість до зв'язування L-PGDS з PGD2 дещо слабша, ніж спорідненість 2 різних типів рецепторів PGD2, тобто D-типу простаноїдних (DP, DP1) рецепторів та CRTH2 (DP2). Тому ми прогнозуємо, що L-PGDS пов'язує хімічно нестійкий PGD2, транспортує PGD2 у позаклітинний простір до місць дії та передає PGD2 до своїх рецепторів.

Ферментативні властивості як PGD Synthase

L-PGDS - це перший ліпокалін, визнаний ферментом. L-PGDS спочатку очищали від мозку щурів 1 як PGD-синтазу (PGH2 D-ізомераза, EC 5.3.99.2), яка каталізує ізомеризацію 9,11-ендопероксидної групи PGH2, загального попередника різних простаноїдів, з отриманням PGD2 з 9-гідрокси та 11-кето групами у присутності сульфгідрильних сполук. PGD2 є основним PG, що виробляється в центральній нервовій системі різних ссавців і бере участь у регуляції сну 23, 24 та ноцицепції12 через DP (DP1) рецептори. 25, 26 PGD2 також активно продукується та секретується тучними клітинами, 18 базофілами та клітинами Th2 27 еволюційно різними H-PGDS, 6 - 8, діючи як алергічний та запальний медіатор через DP (DP1) 25, 28 та CRTH2 ( DP2) 29 рецепторів аутокринним та/або паракринним способом.